正交實(shí)驗(yàn)確定Alcalase水解大豆蛋白的最佳實(shí)驗(yàn)條件＊

孫顯慧

（濰坊職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261041）

大豆蛋白質(zhì)的水解方法可分為酸水解、堿水解和酶水解法等多種方法，由于酸堿水解方法存在許多不足之處，如營(yíng)養(yǎng)成分損失，水解無特異性，副反應(yīng)多，水解產(chǎn)物感官性能差，反應(yīng)條件不易控制等，所以在這方面的研究不是太多。相比而言酶解反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)易于控制，反應(yīng)過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞較小，因此，從1970年代起，日本和美國(guó)的研究學(xué)者就開始致力于酶水解生產(chǎn)大豆蛋白水解產(chǎn)物的研究。在我國(guó)，從1980年代起也有一些科研人員開始研究大豆多肽的酶解法生產(chǎn)。目前為止，酶法水解大豆蛋白質(zhì)生產(chǎn)大豆多肽成了研究的一個(gè)重要方向，用于研究大豆蛋白水解的酶主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶及微生物蛋白酶等；由于各種不同的酶對(duì)蛋白質(zhì)作用的位點(diǎn)不同，得到的產(chǎn)物也就不同，不同的酶也可能給產(chǎn)品帶來不同的風(fēng)味，甚至帶來難以除去的苦味。近幾年來，有人用微生物發(fā)酵技術(shù)制備大豆肽［1］，這種方法將酶的生產(chǎn)和應(yīng)用合二為一，省去了中間步驟，不需要添加額外的酶就可以生產(chǎn)出大豆肽，大大降低了成本，這種制備技術(shù)成了大豆多肽研究的一個(gè)新的方向。

本研究利用枯草桿菌蛋白酶Alcalase對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行水解，得到大豆多肽粗溶液。酶的水解過程往往受到水解的底物、溫度、pH值及酶濃度等多種條件的影響。本研究主要通過正交實(shí)驗(yàn)來確定蛋白酶Alcalase對(duì)大豆分離蛋白的最佳水解條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與主要試劑

大豆分離蛋白粉（蛋白含量91%）（山東濟(jì)南冠力科貿(mào)公司）；枯草桿菌堿性蛋白酶Alcalase2.4L（粉末狀顆粒，標(biāo)注酶活力2.4Au／g，濟(jì)南百泰生物酶制劑有限公司）；6mol／L HCl溶液（分析純）；5mol／L NaOH溶液（分析純）。

1.2 儀器設(shè)備

凱氏定氮裝置（定制）；HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；精密增力電動(dòng)攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）；酸度計(jì)PHS－2型（上海雷磁儀器廠）；721分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；LXJ－Ⅱ型離心沉淀機(jī)（福州醫(yī)療器械廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白酶水解工藝

稱取一定量大豆分離蛋白→溶解至一定濃度→90℃預(yù)處理→冷卻至酶適宜溫度→用5mol／L的NaOH溶液調(diào)酶適pH值→放入以預(yù)熱的恒溫水浴鍋→攪拌→加入一定量的酶制劑，并用5mol／L的NaOH溶液保持反應(yīng)的pH值恒定→反應(yīng)結(jié)束，85℃下滅酶15min→冷卻至50℃以下，用6mol／L的HCl溶液調(diào)至pH4.2→離心分離得上清液。

在蛋白酶水解的過程中應(yīng)嚴(yán)格控制水解的溫度、pH值，盡量保持其水解條件恒定，以使酶水解在酶的最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行。

1.3.2 酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化

酶水解反應(yīng)結(jié)果受反應(yīng)溫度、底物、酶濃度、反應(yīng)pH值及反應(yīng)時(shí)間的影響，為了確定最佳酶解反應(yīng)條件，首先采用單因素多水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，篩選出影響酶反應(yīng)各因素的最佳條件（另文整理）；根據(jù)各因素的最佳條件，列出正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以確定各因素對(duì)酶解反應(yīng)的相互影響作用，最終確定酶解反應(yīng)的最佳條件。

1.3.3 大豆分離蛋白水解度的測(cè)定

大豆分離蛋白酶水解液水解度的測(cè)定采用茚三酮顯色法［2］。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取干燥過的甘氨酸0.1g，溶解后定容至100mL，取2.00mL定容至100ml，得20ug／L的溶液。分別稀釋成含量為2－20ug／L系列溶液，同時(shí)作空白樣。取2.00mL測(cè)定稀釋液于試管，加入1.00mL茚三酮，混勻后置于沸水浴中加熱15min后用冷水冷卻20min加入5.00mL的40%乙醇混勻，放置15分鐘后用1cm比色杯于570nm測(cè)吸光值A(chǔ)，并繪制A－C關(guān)系曲線。

樣品測(cè)定：取0.5mL水解蛋白溶液定容至50mL，取0.4mL稀釋液移入試管中并加入l.6mL蒸餾水，混勻，加入1mL茚三酮顯色劑，混勻后置于沸水浴中加熱15min后用冷水冷卻（同時(shí)作空白），加入5.00mL的40%乙醇溶液混合，放置15min后用1cm比色杯以空白管于570nm調(diào)零測(cè)吸光值A(chǔ)，以此算出－NH2的含量（mmol／L）。

水解度DH計(jì)算：

其中，0.33umol／g：原料大豆蛋白中－NH2的含量；7.8umol／g：每克原料大豆蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素多水平的研究

物濃度、酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值及反應(yīng)時(shí)間等對(duì)Alcalase蛋白酶水解反應(yīng)結(jié)果的影響已另文整理，在此省略。

研究發(fā)現(xiàn)上述各個(gè)因素對(duì)反應(yīng)有著不同程度的影響，但是對(duì)反應(yīng)影響程度的大小不同。但是從各因素對(duì)反應(yīng)的水解度DH及蛋白質(zhì)回收率的影響基本上呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。因此可以取水解度或蛋白質(zhì)回收率為指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以確定酶水解反應(yīng)的最適條件。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)確定Alcalase蛋白酶水解反應(yīng)最佳條件

影響酶反應(yīng)的幾個(gè)主要因素為底物濃度、酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值及反應(yīng)時(shí)間等，根據(jù)以上單因素結(jié)果分析，考慮到對(duì)生產(chǎn)效率的影響，底物濃度采用8%、反應(yīng)時(shí)間2h，選擇反應(yīng)溫度、pH值、酶濃度為三個(gè)影響因素分別取三個(gè)水平，同時(shí)以水解反應(yīng)的蛋白質(zhì)水解度為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交因素水平見表見1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 L9（33）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 L9（33）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析表

從以上分析可以得出，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)（DH）的影響按大小次序來說應(yīng)該是A（溫度）＞C（酶濃度）＞B（PH），最好方案是：A2C2B2，即溫度60℃，酶濃度（E／S）3.6Au／100g底物，反應(yīng)PH8.0。

在正交實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)分析出來的最優(yōu)方案，與它接近的是第4、5號(hào)實(shí)驗(yàn)，在第4號(hào)實(shí)驗(yàn)中只有PH值不處在最好水平，第5號(hào)實(shí)驗(yàn)中酶的濃度不是處于最好水平，但是PH的影響是三因素中最小的，酶濃度對(duì)水解度的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于溫度的影響，而且實(shí)驗(yàn)做出的結(jié)果中第4、5號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，水解度分別為19.3%和21.0%，是9個(gè)平行實(shí)驗(yàn)中的水解度數(shù)值最高的兩個(gè)。第5號(hào)實(shí)驗(yàn)酶的用量增大使水解度增大，取本實(shí)驗(yàn)為最佳實(shí)驗(yàn)會(huì)很大程度上提高生產(chǎn)成本。因此選擇溫度T：60℃，酶濃度（E／S）：3.6Au／100g底物，PH8.0為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案。

3 結(jié)論

利用Alcalase蛋白酶水解大豆分離蛋白，底物濃度采用8%、反應(yīng)時(shí)間2h，選擇反應(yīng)溫度T、PH值、酶濃度為三個(gè)影響因素分別取三個(gè)水平，以水解反應(yīng)的蛋白質(zhì)水解度為指標(biāo)進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)。通過正交實(shí)驗(yàn)確定了Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白得到大豆多肽溶液的最佳實(shí)驗(yàn)條件：底物濃度8%，酶濃度（E／S）3.6Au／100g底物，溫度60℃，PH8.0。

［1］趙芳芳，張日俊.大豆肽的功能及其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用前景［J］.獸藥與飼料添加劑，2003，（8）：17－18.

［2］郭興鳳.蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定［J］.中國(guó)油脂，2000，25（6）：176－177.