吡喹酮混懸注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

楊海峰，李勇軍＊，金禮琴，趙杉杉，孫愛(ài)榮，喬新月

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300；2.江蘇倍康藥業(yè)有限公司，江蘇泰州225300）

血吸蟲(chóng)病是一種由血吸蟲(chóng)感染所引起的嚴(yán)重危害人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患寄生蟲(chóng)病，流行于全世界76個(gè)國(guó)家和地區(qū)［1］。在大規(guī)模徹底滅螺和血吸蟲(chóng)病疫苗臨床應(yīng)用實(shí)現(xiàn)之前，抗血吸蟲(chóng)藥物仍是防治血吸蟲(chóng)病的主要手段。吡喹酮（praziquantel，PZQ）為廣譜抗血吸蟲(chóng)和抗絳蟲(chóng)藥，適用于各種血吸蟲(chóng)病、華支睪吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病、姜片吸蟲(chóng)病以及絳蟲(chóng)病和囊蟲(chóng)?。?－3］。吡喹酮是目前防治血吸蟲(chóng)病的首選藥物，其作用機(jī)理主要是通過(guò)5－羥色胺樣作用引起蟲(chóng)體活動(dòng)興奮，同時(shí)影響Ca2＋的通透性引起蟲(chóng)體肌肉攣縮和皮層受損，繼而導(dǎo)致蟲(chóng)體表面抗原決定簇暴露，宿主的免疫效應(yīng)得以發(fā)揮，促使蟲(chóng)體死亡［4－5］。

家畜（特別是耕牛）作為主要的保蟲(chóng)宿主和傳染源，在血吸蟲(chóng)病的流行過(guò)程中起著重要的傳播作用。采用吡喹酮治療病畜，最大限度消滅病畜體內(nèi)的蟲(chóng)體，減少或杜絕病原對(duì)環(huán)境的污染是控制血吸蟲(chóng)病重要而有效的措施之一。目前，我國(guó)批準(zhǔn)使用獸用吡喹酮制劑有片劑和粉劑兩種劑型［6－7］，但由于吡喹酮具有低溶解度、高滲透性、內(nèi)服首過(guò)效應(yīng)明顯和生物利用度低的特點(diǎn)，影響了其臨床效應(yīng)的發(fā)揮［8］。因此，提高吡喹酮生物利用度和有效血藥濃度維持時(shí)間的新制劑開(kāi)發(fā)成為防治血吸蟲(chóng)病的研究熱點(diǎn)［9－10］。近幾年，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的吡喹酮新制劑有吡喹酮固 體 分 散 體［8］、注 射 劑［11－13］、透 皮 劑［14］、納 米乳［15］和脂質(zhì)體凍干劑［16］等。

針對(duì)吡喹酮的理化性質(zhì)和藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，課題組研制了30%吡喹酮混懸注射液，擬用于家畜血吸蟲(chóng)病的防治。為評(píng)價(jià)和控制吡喹酮混懸注射液的質(zhì)量，確保臨床用藥的安全性和有效性，本試驗(yàn)依據(jù)2010年版《中國(guó)獸藥典》一部［6］和農(nóng)業(yè)部新獸藥評(píng)審中心《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》［17］的相關(guān)技術(shù)規(guī)范，建立了吡喹酮混懸注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 扁平式氣流粉碎機(jī)，南京理工大學(xué)國(guó)家特種超細(xì)粉體工程技術(shù)研究中心；FJ－200型高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；BG 型半自動(dòng)液體灌裝機(jī)，江蘇永和制藥機(jī)械有限公司；KFJ－S40型封口蓋機(jī)，南通市華中包裝材料有限公司；UV－2250型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；LC－10Avp型高效液相色譜儀，日本島津公司；AS1201型自動(dòng)進(jìn)樣器，大連依利特公司；BS224S型電子天平，北京賽多利斯公司。

1.1.2 主要試劑 吡喹酮混懸注射液，規(guī)格100 mL：30g，批號(hào)110419、110423、110427，江蘇倍康藥業(yè)有限公司制備；吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙腈，色譜純，美國(guó)TEDEA 公司生產(chǎn)；206佐劑，賽彼科上海特殊化學(xué)品有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 外觀性狀 依據(jù)2010年版《中國(guó)獸藥典》一部制劑通則要求，對(duì)3批樣品進(jìn)行外觀性狀考察。

1.2.2 鑒別

1.2.2.1 紫外－可見(jiàn)分光光度法 取搖勻后的吡喹酮混懸注射液適量，加乙醇制成每1m L 中含0.6 mg吡喹酮的溶液，按照紫外－可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，檢測(cè)其最大吸收波長(zhǎng)是否與吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品一致。

1.2.2.2 高效液相色譜法 取吡喹酮混懸注射液樣品，按含量測(cè)定項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，觀察供試品溶液主峰的保留時(shí)間與吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液主峰的保留時(shí)間是否一致。

1.2.3 檢查

1.2.3.1 粒度 采用顯微鏡法測(cè)定吡喹酮混懸注射液的粒度，《中國(guó)獸藥典》制劑通則要求，混懸型注射液不得檢出50μm 及以上粒子，15μm 以下的顆粒不得少于90%，15μm～20μm 的顆粒不得超過(guò)10%。

1.2.3.2 分散性 取3批次吡喹酮混懸注射液，強(qiáng)力振搖30s，分別將供試品轉(zhuǎn)移置玻璃容器中檢視，應(yīng)分散均勻，無(wú)結(jié)塊現(xiàn)象。

1.2.3.3 裝量 采用最低裝量檢查法（容量法）檢查吡喹酮混懸注射液裝量，《中國(guó)獸藥典》制劑通則要求，注射液的標(biāo)示裝量為50mL～500mL，每瓶的裝量均不得少于其標(biāo)示裝量的97%。

1.2.3.4 無(wú)菌 取吡喹酮混懸注射液10瓶，充分混勻后取100mL，加入適量的二甲亞砜稀釋液，溶解后，立即過(guò)濾，用含1g／L聚山梨酯80為沖洗液，采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查。

1.2.4 含量測(cè)定

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6mm，5μm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：乙腈－水（60∶40）；流速：1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品工作液制備 取吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品60.37 mg，加無(wú)水乙醇定容至100 mL，得濃度為603.7μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，使用前用流動(dòng)相稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

1.2.4.3 供試品溶液制備 吡喹酮混懸注射液搖勻，用移液管精密量取2mL，置100mL 容量瓶中，用無(wú)水乙醇50mL，分5次洗滌移液管內(nèi)壁，洗液并入容量瓶中，搖勻，置水浴中超聲10min，加無(wú)水乙醇緩慢稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.4.4 陰性對(duì)照液制備 按處方比例精密稱取吡喹酮混懸注射液中除吡喹酮原料藥外的其他成份，同吡喹酮混懸注射液工藝制備，再按供試品溶液的制備方法處理，即得陰性對(duì)照液。

1.2.4.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別取陰性對(duì)照液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液20μL，按“1.2.4.1項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。

1.2.4.6 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量加到流動(dòng)相中，得濃度分別為6.037、12.074、30.185、60.37、90.555μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，取20μL進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（A）對(duì)吡喹酮濃度（C）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4.7 精密度試驗(yàn) 取吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品工作液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量20μL，依法測(cè)定峰面積，觀察其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在供試品溶液制備0、4、8、12、24h后，精密量取20μL，依法測(cè)定峰面積，考察其穩(wěn)定性。

1.2.4.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密取吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品和輔料適量，按處方制成吡喹酮射液的模擬樣品，然后制備高、中、低3種濃度共9份樣品溶液，測(cè)定吡喹酮濃度，與加入值進(jìn)行比較，計(jì)算加樣回收率。

1.2.4.10 含量測(cè)定 取3批吡喹酮混懸注射液樣品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量（以標(biāo)示量的百分含量表示）。

2 結(jié)果

2.1 性狀

本品為吡喹酮與206佐劑、注射用水等配制而成的白色至類白色混懸注射液，久置分層，振搖后均勻。

2.2 鑒別結(jié)果

2.2.1 紫外－可見(jiàn)分光光度法 吡喹酮混懸注射液的紫外光譜掃描圖見(jiàn)圖1，其吸收峰特征明顯，3批次樣品最大吸收波長(zhǎng)見(jiàn)表1，吡喹酮混懸注射液的最大吸收波長(zhǎng)與吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品一致（獸藥典規(guī)定測(cè)定誤差可允許為±1nm），故將紫外吸收光譜法作為鑒別依據(jù)。

圖1 吡喹酮混懸注射液的紫外光譜掃描圖Fig.1 UV scanning pectrum of praziquantel suspension injection

表1 紫外吸收光譜鑒別結(jié)果Table 1 Identification results of the UV absorption spectrum

2.2.2 高效液相色譜法 陰性對(duì)照液、吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品和吡喹酮混懸注射液的色譜圖分別見(jiàn)圖2～圖4，可見(jiàn)供試品溶液主峰的保留時(shí)間與吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液一致，陰性對(duì)照液在相應(yīng)位置無(wú)吸收，故將高效液相色譜法作為鑒別依據(jù)。

2.3 檢查結(jié)果

2.3.1 粒度檢查結(jié)果 吡喹酮混懸注射液15μm以下的顆粒在90%以上，15μm～20μm 的顆粒不超過(guò)10%，粒度檢查結(jié)果符合規(guī)定（表2）。

圖2 陰性對(duì)照液色譜圖Fig.2 Chromatogram of negative sample

圖3 吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 Chromatogram of praziquantel standard

圖4 吡喹酮混懸注射液色譜圖Fig.4 Chromatogram of praziquantel suspension injection

表2 粒度檢查結(jié)果Table 2 Results of granularity inspection

2.3.2 分散性檢查結(jié)果 吡喹酮混懸注射液分散均勻，無(wú)結(jié)塊現(xiàn)象，分散性檢查結(jié)果符合規(guī)定。

2.3.3 裝量檢查結(jié)果 裝量檢查結(jié)果見(jiàn)表3，3批吡喹酮混懸注射液的每瓶裝量為100.8mL～102.2 mL（獸藥典規(guī)定不少于標(biāo)示裝量的97%），平均裝量分別為101.4、101.8、101.9mL（獸藥典規(guī)定不少于標(biāo)示裝量），裝量檢查結(jié)果符合規(guī)定。

表3 裝量檢查結(jié)果Table 3 Results of volume check

2.3.4 無(wú)菌檢查結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照管24h～48h后生長(zhǎng)良好，供試品管和陰性對(duì)照管14d 內(nèi)無(wú)菌生長(zhǎng)，吡喹酮混懸注射液無(wú)菌檢查結(jié)果符合規(guī)定。

2.4 含量測(cè)定結(jié)果

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 供試品溶液主峰與其他雜質(zhì)峰分離效果好，保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品溶液一致，陰性對(duì)照液在相應(yīng)位置無(wú)吸收，表明方法專屬性好。

2.4.2 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果 以峰面積（A）對(duì)吡喹酮濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A ＝93 729C＋89 501（r＝0.999 3），線性范圍6.037 μg／mL～90.55μg／mL。

2.4.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 取吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品工作液重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定，其峰面積的RSD 為0.15%（n＝6），表明方法精密度符合要求。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 24h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)取供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，其峰面積的RSD 為0.13%，表明供試品溶液至少可以穩(wěn)定24h。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，平均回收率為99.24%，RSD 為0.77%（n＝9）。

2.4.6 含量測(cè)定結(jié)果 吡喹酮混懸注射液的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，3 批樣品的平均含量為標(biāo)示量的100.3%，綜合考慮一般注射液含量限度要求、吡喹酮混懸注射液的規(guī)格、裝量及及其混懸特點(diǎn)，規(guī)定本品含吡喹酮（C19H24N2O2）應(yīng)為標(biāo)示量的93%～107%。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery test（n＝9）

表5 吡喹酮混懸注射液含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of praziquantel suspension injection content

3 討論

獸藥研發(fā)過(guò)程中，需對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)、深入的研究，以制定出科學(xué)、合理、可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并不斷地進(jìn)行修訂和完善，從而控制獸藥的質(zhì)量，保證其在有效期內(nèi)安全有效［17］。獸藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為了使用獸藥安全有效而制訂的控制獸藥質(zhì)量規(guī)格和檢驗(yàn)方法的規(guī)定，是獸藥生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)、銷售和使用的質(zhì)量依據(jù)，亦是檢驗(yàn)和監(jiān)督管理部門共同遵循的法定技術(shù)依據(jù)。

本試驗(yàn)在成功制備30%吡喹酮混懸注射液的基礎(chǔ)上，從外觀性狀、鑒別、檢查、含量測(cè)定等方面進(jìn)行吡喹酮混懸注射液的質(zhì)量研究，建立了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。

吡喹酮混懸注射液為吡喹酮與206佐劑、注射用水等制成的混懸型注射劑，久置分層，振搖后成均勻的白色至類白色混懸液。在鑒別試驗(yàn)中，采用了各國(guó)獸藥典普遍采用的，專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的紫外－可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜法，其鑒別操作簡(jiǎn)單、特征明顯，故將二者列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。對(duì)粒度、分散性、裝量差異、無(wú)菌檢查等檢查項(xiàng)目進(jìn)行方法驗(yàn)證和測(cè)定，檢查結(jié)果均符合中國(guó)獸藥典的規(guī)定。

在含量測(cè)定試驗(yàn)中，采用HPLC 法測(cè)定吡喹酮混懸注射液中吡喹酮含量。根據(jù)吡喹酮的紫外掃描吸收特征，起初選擇263nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。2010年版《中國(guó)獸藥典》一部中，吡喹酮原料藥的檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm［6］。試驗(yàn)證實(shí)在該檢測(cè)波長(zhǎng)下HPLC檢測(cè)方法的靈敏度有所提高，故最終將檢測(cè)波長(zhǎng)定為210nm。為避免吡喹酮和注射液中輔料色譜行為的相互干擾，篩選了甲醇－水、乙腈－水等流動(dòng)相，并根據(jù)色譜分離效果調(diào)整流動(dòng)相組分的體積比，最終確定流動(dòng)相為乙腈－水（60∶40）。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用HPLC法測(cè)定注射液中吡喹酮含量，吡喹酮主峰分離效果好、保留時(shí)間適宜，方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度和回收率高、測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。吡喹酮混懸注射液的含量限度根據(jù)注射劑一般要求以及樣品劑型、裝量、規(guī)格等自身特點(diǎn)，定為標(biāo)示量的93%～107%。綜上所述，30%吡喹酮混懸注射液質(zhì)量可靠，所建立的質(zhì)量分析方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，能準(zhǔn)確的進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，可用于吡喹酮混懸注射液的質(zhì)量控制。

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