滸苔多糖體外抗豬傳染性胃腸炎病毒研究

孫秋艷，沈美艷

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東濰坊261061）

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種以嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的高度接觸性傳染?。?－3］。豬場一旦暴發(fā)此病，可造成新生仔豬100%死亡，損失相當嚴重。該病目前尚無有效的治療藥物，采用疫苗免疫接種是主要的預(yù)防措施，但現(xiàn)有TGEV 疫苗在免疫效果和安全性方面存在著一定的缺陷，所以該病只能對癥治療。應(yīng)用抗生素易產(chǎn)生耐藥性和殘留問題，抗生素殘留不但導(dǎo)致抗藥性的增加，還威脅著人類生命安全，國外將抗生素殘留問題作為一種技術(shù)貿(mào)易壁壘，制約著我國動物性食品的出口。因此，研發(fā)天然、低毒、無藥物殘留的綠色生物制劑成為預(yù)防和治療該病的方向之一。

滸苔（Enteromorpha）俗稱苔條、海苔，是綠藻植物石莼科中的水生藻類植物。滸苔作為海域的天然海藻，產(chǎn)量極大，而且大量滸苔生長會對海洋環(huán)境造成生態(tài)危害，是成本低廉的綠色植物。滸苔多糖［4］是滸苔的關(guān)鍵活性成分，研究表明滸苔多糖具有抑制皮膚 癌［5］、抗腫瘤［6－7］、降血脂［8］、降 血 糖［9］、抗 氧化［10］、抗細 菌［11－12］及 免 疫 調(diào) 節(jié) 等 功 能［13－14］。滸 苔 多糖與抗生素相比較具有潛在的應(yīng)用價值。目前對滸苔多糖的抗病毒功能國內(nèi)外鮮有研究，尤其是滸苔多糖抗TGEV 的研究未見報道。本試驗通過滸苔多糖對TGEV 體外抑制作用的研究，為滸苔多糖抗病毒作用和滸苔多糖生物制劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 滸苔多糖的提取 新鮮滸苔（藻體暗綠色，管狀扁壓，中空，主枝明顯，分枝較多，密集且細長，符合滸苔特征）8 月份采自青島海域，清洗干凈，晾干后按照水煮醇沉法提?。?5］：將滸苔研磨至粉末，用電子天平精確稱取粉末加水，100℃煮沸4h，重復(fù)3次；合并3次濾液濃縮，加入3倍量950mL／L 乙醇3 000r／min離心20min；取沉淀加入適量超純水完全溶解，胰蛋白酶消化，Sevage法除蛋白，透析；透析袋內(nèi)液加入950mL／L乙醇至濃度為600mL／L，靜置，離心；沉淀加無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌除脂；得滸苔多糖粗品。用苯酚－硫酸法［16］測得多糖含量為680g／L。高壓滅菌，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 毒株和細胞 豬傳染性胃腸炎病毒－pudue（TGEV－pudue）株、豬睪丸細胞（swine testicle cell，ST）均由復(fù)旦大學醫(yī)學院病原生物系王玉燕老師惠贈。細胞生長液用含100 mL／L 胎牛血清的DMEM，病毒增殖的維持液為含50mL／L胎牛血清的DMEM。

1.1.3 試劑 DMEM（Gibco）、胎牛血清（Gibco）均購自Invirogen公司；胰蛋白酶購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TGEV 毒力TCID50的測定 將ST 細胞［17］進行消化傳代，將細胞數(shù)調(diào)整至1×106個／mL，加至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔0.1 mL，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，待細胞長成單層后，將TGEV 進行10×系列稀釋，選取適當稀釋度，每一稀釋度接種96孔板中的8孔，每孔0.1 mL，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔24h觀察CPE情況，至96h。按Reed－Muench［18］公式計算TCID50。

1.2.2 滸苔多糖對ST 細胞安全濃度的測定（CPE法） 稱取高壓滅菌滸苔多糖粗品1g加入20 mL細胞維持液中溶解，用細胞維持液作2倍連續(xù)倍比稀釋，加到長成單層ST 的96孔細胞培養(yǎng)板上，0.1 mL／孔，每個稀釋度重復(fù)8 孔，另設(shè)細胞對照，置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)96h，每隔12h觀察CPE 情況，細胞病變率的表示方法：“－”表示無細胞病變；1個“＋”表示10%細胞有病變。根據(jù)結(jié)果將滸苔多糖用細胞維持液稀釋到ST 細胞安全濃度范圍，再用細胞維持液對安全濃度滸苔多糖作2倍連續(xù)倍比稀釋。

1.2.3 滸苔多糖直接殺滅TGEV 作用的測定 選10個遞增稀釋度倍比稀釋的稀釋液分別與等體積1 000TCID50病毒液混合，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2溫箱中作用2h和4h，加到長成單層ST 的96孔細胞培養(yǎng)板上，0.1 mL／孔，每個稀釋度重復(fù)4孔，另設(shè)細胞對照和病毒對照。37℃、體積分數(shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔4h觀察CPE，當病毒對照CPE達到100%時，記錄各孔CPE情況。

1.2.4 滸苔多糖抑制TGEV 復(fù)制作用的測定 先將1 000TCID50病毒液接種至長成單層ST 的96孔細胞培養(yǎng)板上，0.1mL／孔，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2溫箱中吸附2h和4h，棄去病毒液，加入2倍倍比稀釋的滸苔多糖稀釋液，0.1mL／孔，每個稀釋度重復(fù)8孔，另設(shè)細胞對照和病毒對照。37℃、體積分數(shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔4h觀察CPE，當病毒對照CPE 達到100%時，記錄各孔CPE 情況。

1.2.5 滸苔多糖阻斷TGEV 吸附作用的測定 選取10個遞增稀釋度的2倍倍比稀釋的滸苔多糖稀釋液加到長成單層ST 的96 孔細胞培養(yǎng)板上，0.1 mL／孔，每個稀釋度重復(fù)4 孔。37℃、體積分數(shù)為5%的CO2溫箱中作用2h和4h，棄去滸苔多糖稀釋液，每孔加入1 000TCID50病毒液0.1mL，37 ℃吸附2h，棄去病毒液，加入維持液，另設(shè)細胞對照和病毒對照。37℃、體積分數(shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔4h觀察CPE，當病毒對照CPE達到100%時，記錄各孔CPE情況。

2 結(jié)果

2.1 TGEV 毒力TCID50的測定

標 準 毒 株TGEV－pudue 株 在ST 細 胞 上 的TCID50為10－6.64／0.1mL。

2.2 滸苔多糖對ST 細胞安全濃度的測定

根據(jù)96h觀察CPE結(jié)果表明，滸苔多糖粗品稀釋到1.57mg／mL對ST 細胞的作用與對照組無明顯差異，ST 細胞的形態(tài)均未有明顯改變。因此確定滸苔多糖對ST 細胞無毒性濃度小于1.57mg／mL（圖1A 和圖1B）。

圖1 正常的ST 細胞與感染TGEV 的ST 細胞（100×）Fig.1 Normal and TGEV infected ST cells（100×）

2.3 滸苔多糖對直接殺滅TGEV 作用的測定結(jié)果

滸苔多糖對TGEV 具有直接殺滅作用，在ST細胞安全濃度范圍內(nèi)，滸苔多糖對TGEV 直接殺滅作用與滸苔多糖濃度和與TGEV 直接作用的時間有關(guān)。滸苔多糖濃度越高、與TGEV 作用時間越長對TGEV 直接殺滅作用就越明顯，滸苔多糖與TGEV 作用2h的最小殺滅濃度為0.2mg／mL，作用4h的最小殺滅濃度為0.1mg／mL（圖2）。

圖2 滸苔多糖直接殺滅TGEV 作用后ST 細胞病變率Fig.2 Cytopathic rate of ST cells after of Enteromorpha polysaccharide action to TGEV

2.4 滸苔多糖抑制TGEV 復(fù)制作用的測定結(jié)果

滸苔多糖對TGEV 復(fù)制的抑制作用效果不甚明顯，但仍有一定效果，在ST 細胞安全濃度范圍內(nèi)，滸苔多糖對TGEV 復(fù)制的抑制作用與滸苔多糖濃度和病毒感染細胞的時間有關(guān)。滸苔多糖濃度越高效果越明顯，TGEV 感染細胞時間越長，滸苔多糖對其抑制作用越低。滸苔多糖對TGEV 復(fù)制的抑制作用的最小濃度為1.57mg／mL（圖3）。

圖3 滸苔多糖抑制TGEV 復(fù)制作用的ST 細胞病變率Fig.3 Cytopathic rate of ST cells after Enteromorpha polysaccharide inhibiting TGEV replication

2.5 滸苔多糖阻斷TGEV 吸附作用的測定

滸苔多糖對TGEV 吸附ST 細胞阻斷作用明顯。在ST 細胞安全濃度范圍內(nèi)，滸苔多糖的濃度越高，滸苔多糖作用于細胞的時間越長對TGEV 阻斷作用越明顯。滸苔多糖對TGEV 吸附ST 細胞阻斷作用最小濃度與滸苔多糖作用于ST 細胞的時間有關(guān)，2h 為0.393 mg／mL，4h 為0.2 mg／mL（圖4）。

圖4 滸苔多糖阻斷TGEV 吸附作用ST 細胞病變率Fig.4 Cytopathic rate of ST cells after Enteromorpha polysaccharide blocking TGEV adsorption

3 討論

滸苔作為海藻的一種，給人們印象最深的不是它的藥用和營養(yǎng)價值，而是對海水的污染，大量滸苔漂浮聚集到岸邊，阻塞航道，同時破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)，嚴重威脅沿海漁業(yè)、旅游業(yè)發(fā)展。本試驗通過水煮醇沉法提取滸苔多糖，并研究滸苔多糖對TGEV體外抑制作用，是變廢為寶利國利民的事情。滸苔多糖提取采用的是水煮醇沉法，提取出多糖粗品含有很多的雜質(zhì)，有可能對ST 細胞具有毒性作用，為了提高滸苔多糖的抗病毒效果還需要優(yōu)化滸苔多糖提取和試驗方法。

本試驗結(jié)果表明，滸苔多糖對TGEV 具有直接殺滅作用，而且多糖濃度越高作用時間越長，直接殺滅作用越好。滸苔多糖對進入細胞內(nèi)病毒抑制作用不明顯，原因可能是TGEV 進入細胞的速度太快而多糖進入細胞的速度太慢。滸苔多糖對TGEV 吸附細胞具有明顯的阻斷作用，因此滸苔多糖對TGEV 在體外具有一定的抑制作用。本試驗初步證實滸苔多糖有抗病毒的能力，為滸苔多糖在臨床上對病毒病的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。

［1］ 殷 震，劉景華.動物病毒學［M］.2 版，北京：科學出版社，1997.

［2］ 焦 洋，姜 焱，王凱民，等.豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬博卡病毒多重PCR 檢測方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（8）：71－75.

［3］ 鄭世民，周首龍，趙良友，等.豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二聯(lián)RT－PCR檢測方法的建立［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2014，45（6）：57－60.

［4］ 魏鑒騰，裴 棟，劉永峰，等.滸苔多糖的研究進展［J］.海洋科學，2014，38（1）：91－94.

［5］ Higashi－Okai K，Otani S，Okai Y.Potent suppressive effect of a Japanese edible seaweed，Enteromorpha proliferu（Sujiao－nori）on initiation and promotion phases of chemically induced mouse skin tumorigenesis［J］.Cancer Lett，1999，140（1）：21－25.

［6］ 王 劍.海藻多糖抗腫瘤作用機制的研究進展［J］.實用醫(yī)藥雜志，2012，29（7）：655－656.

［7］ Shao P，Pei Y，F(xiàn)ang Z，et al.Effects of partial desulfation on antioxidant and inhibition of DLD cancer cell of Ulva fasciata polysaccharide［J］.Int J Biol Macromol，2014，65（4）：307－313.

［8］ Teng Z，Qian L，Zhou Y.Hypolipidemic activity of the polysaccharides from Enteromorpha prolifera［J］.Int J Biol Macromol，2013，62（11）：254－256.

［9］ 孫士紅，陳 艷，劉 瑩.堿提滸苔多糖降血糖作用研究［J］.中國醫(yī)學創(chuàng)新，2010，7（20）：181－182.

［10］ Mezghani S，Bourguiba I，Hfaiedh I，et al.Antioxidant potential of Ulva rigida extracts：protection of HeLa cells against H2O2cytotoxicity［J］.Biol Bull，2013，225（1）：1－7.

［11］ 高玉杰，呂海濤.滸苔多糖和硒化滸苔多糖抑菌作用研究［J］.食品科技，2013，38（1）：195－198，205.

［12］ LüH，Gao Y，Shan H，et al.Preparation and antibacterial activity studies of degraded polysaccharide selenide fromEnteromorpha prolifera［J］.Carbohydr Polym，2014，107（7）：98－102.

［13］ Wei J，Wang S，Liu G，et al.Polysaccharides fromEnteromorpha prolifera enhance the immunity of normal mice［J］.Int J Biol Macromol，2014，64：1－5.

［14］ Yang T H，Jia M，Zhou S Y，et a1.Antivirus and immune enhancement activities of sulfated polysaccharide fromAngelica sinensis［J］.Int J Biol Macromol，2012，50：768－772.

［15］ 許福超，薛志欣，葉乃好，等.滸苔多糖的提取、提純和分析［J］.科學技術(shù)與工程，2010，10（10）：2413－2415，2433.

［16］ 左雪梅，崔國林，楊世發(fā)，等.泰山松花粉多糖和乳酸桿菌對禽波氏桿菌OMP亞單位疫苗免疫增強的協(xié)同作用［J］.中國獸醫(yī)學報，2013，33（11）：1662－1667.

［17］ 魏 鳳，管 宇，肖躍強.PK15、ST 細胞增殖豬傳染性胃腸炎病毒的比較研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014，（1）：125－126.

［18］ 趙 昕，孫 娜，白喜云，等.苦參堿對PRRSV 的體外抑制作用及其機制［J］.中國獸醫(yī)學報2013，33（6）：808－811.