芪參益氣滴丸用于大鼠急性心肌梗死的代謝組學(xué)研究

金文敏，穆殿平

(天津市第一中心醫(yī)院,天津 300192)

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芪參益氣滴丸用于大鼠急性心肌梗死的代謝組學(xué)研究

金文敏，穆殿平*

(天津市第一中心醫(yī)院,天津 300192)

目的：采用UPLC/MS技術(shù)從代謝組學(xué)角度探討芪參益氣滴丸對(duì)心肌梗死大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。方法：將60只SD雄性大鼠隨機(jī)等分為正常對(duì)照組、模型組和給藥組，采用結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型。給藥組灌胃給予芪參益氣滴丸，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水,給藥1周后，腹主動(dòng)脈取血采用UPLC/MS法分析。結(jié)果：經(jīng)主成分分析及偏最小二乘法分析，模型組與正常對(duì)照組明顯分離，而藥物干預(yù)組與模型組分離，并向正常對(duì)照組靠近，在代謝組學(xué)的角度證明了芪參益氣滴丸對(duì)心肌梗死大鼠的治療作用。實(shí)驗(yàn)共分析鑒別出9個(gè)內(nèi)源性生物標(biāo)記物，分別與磷脂代謝、能量代謝和脂肪酸代謝通路相關(guān)。 結(jié)論：芪參益氣滴丸可以對(duì)心肌梗死大鼠起到很好的保護(hù)作用，推測(cè)其可能是通過調(diào)節(jié)磷脂代謝、能量代謝和脂肪酸代謝通路而發(fā)揮作用。

芪參益氣滴丸，心肌梗死，代謝組學(xué)，生物標(biāo)記物

芪參益氣滴丸由丹參、三七、黃芪和降香4味藥材組成，其中黃芪補(bǔ)中益氣、丹參活血化瘀，共為君藥；三七止血化瘀、活血定痛為臣藥；降香行氣活血為佐使藥，臨床主要用于冠心病、心力衰竭和心絞痛等疾病的治療?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，芪參益氣滴丸能夠改善心肌損傷，心功能減退的各種癥狀，且對(duì)心肌梗死二級(jí)預(yù)防具有顯著的療效[1]。

代謝組學(xué)運(yùn)用系統(tǒng)的研究手段，分析生物體受病理生理學(xué)過程或基因變異等干擾刺激后，其體內(nèi)內(nèi)源性代謝物隨時(shí)間和各個(gè)組織變化的全部代謝變化響應(yīng)[2,3]。

本研究采用代謝組學(xué)的方法，利用超高效液相色譜-四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF)對(duì)芪參益氣滴丸給藥干預(yù)心肌梗死大鼠的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化進(jìn)行分析，為心肌梗死的臨床診斷和藥物治療評(píng)價(jià)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器 MP-150多導(dǎo)生理記錄儀(BIOPAC systems Inc.，USA)，超高效液相色譜儀串聯(lián)四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜(Waters ACQUITYTM UPLC-Q/TOF Premier)，超純水儀Milli-Q(美國MILLIPORE公司)，Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，MS2型旋渦混勻器(德國IKA集團(tuán))。

1.1.2 試藥 乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher)，亮氨酸-腦啡肽醋酸鹽(美國Sigma-Aldrich公司)，水合氯醛(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，分析純)，青霉素鈉注射液(北京悅康凱悅制藥有限公司)，芪參益氣滴丸(天津天士力制藥股份有限公司，批號(hào)141208)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重(230±20) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(京)2012-0004]。

2 方法

2.1 模型的建立 大鼠腹腔注射300 mg/kg水合氯醛麻醉，仰臥位固定，備皮。記錄正常時(shí)的Ⅱ?qū)?lián)心電圖，心電圖無異常者入組實(shí)驗(yàn)。沿左側(cè)第4～5肋骨剪開胸部皮膚，橫行分離肌肉，暴露心臟后輕壓右胸，將心臟擠出胸腔外，使用5-0帶針縫合線，于左前降支起始4 mm處穿線，然后立即將心臟回置胸腔，止血鉗關(guān)閉胸腔。穩(wěn)定10 min后，結(jié)扎動(dòng)脈，縫合傷口。記錄觀察大鼠心電圖，結(jié)扎后心電圖ST段明顯抬高者造模成功。大鼠術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉預(yù)防感染。

2.2 動(dòng)物分組、給藥及樣品收集 實(shí)驗(yàn)大鼠分為三組，正常對(duì)照組、模型組和給藥組，每組各20只。給藥組灌胃給予芪參益氣滴丸(70 mg/kg)1周，正常對(duì)照組及模型組分別灌胃給予等量生理鹽水。大鼠給藥7 d后，將其麻醉，腹主動(dòng)脈取血于裝有肝素的離心管中，3 000 r/min離心10 min后取上清液存于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品的處理 用移液管取400 μl血漿樣品，加入1 600 μl的50%甲醇，渦旋2 min后在4 ℃條件下13 000 r/min離心15 min，取上清液1 500 μl減壓濃縮后再加入200 μl 50%甲醇渦旋復(fù)溶，之后在4 ℃條件下13 000 r/min離心15 min，取上清液直接用于液質(zhì)分析。

2.4 樣品的測(cè)定

2.4.1 色譜條件 實(shí)驗(yàn)采用Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相：乙腈和0.1%甲酸水梯度洗脫，流速為0.4 ml/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣5.0 μl，梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜流動(dòng)相條件

2.4.2 質(zhì)譜條件 實(shí)驗(yàn)采用電噴霧離子源，正、負(fù)兩種模式測(cè)定。參數(shù)為：錐孔電壓負(fù)模式25 V、正模式30 V；毛細(xì)管電壓負(fù)模式2.5 kV、正模式3.0 kV；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃；脫溶劑氮?dú)饬髁?00 L/h；錐孔氣流量50 L/h；檢測(cè)器電壓1 800 V；采樣頻率0.1 s，間隔0.02 s；質(zhì)量數(shù)檢測(cè)范圍100～1 200 Da；內(nèi)參校準(zhǔn)液采用亮氨酸-腦啡肽醋酸鹽([M-H]-=553.277 5，[M+H]+=555.293 1)。

2.5 數(shù)據(jù)分析 將所有的液質(zhì)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Waters公司Markerlynx軟件(Waters, MA, USA)進(jìn)行色譜峰自動(dòng)識(shí)別和峰匹配，采用主成分分析法對(duì)正常對(duì)照組與模型組以及正常對(duì)照組、模型組與給藥組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別。初步分析后，再將結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Simca-P 軟件 (version 11.5, Demo, Umetrics, Umea, Sweden)進(jìn)行進(jìn)一步的偏最小二乘法分析，得到各組間的得分圖和載荷圖。

3 結(jié)果

3.1 心肌梗死生物標(biāo)記物分析 如圖1所示，為通過UPLC-Q-TOF/MS分析得到的正、負(fù)模式下大鼠正常對(duì)照組、模型組及給藥組血漿樣本的色譜圖。雖然能部分辨別各組色譜圖的峰數(shù)和峰強(qiáng)度存在差異，但是這種肉眼直接對(duì)比得到的信息十分有限。所以，需要對(duì)質(zhì)譜圖中所包含的所有離子信息進(jìn)行信息提取和再處理，以獲取更多的數(shù)據(jù)。通過對(duì)正常對(duì)照組和模型組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA及PLS-DA分析，得到了正負(fù)模式下的得分圖(見圖2)和載荷圖(見圖3)。

從得分圖中發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組和模型組樣品得到了明顯的分離，說明大鼠心肌梗死造模后血液中內(nèi)源性物質(zhì)的代謝發(fā)生顯著異常。另外，從圖中還可以看出模型組較正常對(duì)照組樣品更加分散，說明模型組個(gè)體差異較正常對(duì)照組大。

3.2 心肌梗死生物標(biāo)記物的鑒別 圖3為正常對(duì)照組和心梗模型組的PLS-DA載荷圖，從圖3中可分析得到對(duì)兩組分類貢獻(xiàn)較大的內(nèi)源性生物標(biāo)記物。依據(jù)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的化合物對(duì)于分型的貢獻(xiàn)越大的原則，選取了9個(gè)色譜峰為生物標(biāo)記物。通過將這些生物標(biāo)記物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫Metabolites Database(http://metlin.scrips.edu)和Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca)進(jìn)行比對(duì)鑒定，共分析出9個(gè)生物標(biāo)記物(見表2)，分別為尿苷-磷酸、油酰甘油磷酯酰膽堿、溶血磷脂膽堿(LPC C20:4)、磷脂酰乙醇胺、羥基二十碳四烯酸、N-甲基花生四烯酰胺、溶血磷脂膽堿(LPC C18:1)、硬脂酰甘油磷脂酰膽堿和溶血磷脂膽堿(LPC C18:0)。其中，有2個(gè)標(biāo)記物在模型組中表現(xiàn)為上調(diào)，7個(gè)標(biāo)記物在模型組中為下調(diào)。由于這些生物標(biāo)志物是正常對(duì)照組與心梗組中有差異的離子，因此很可能反應(yīng)了心肌梗死引起的內(nèi)源性代謝物的變化情況。

A.正模式 B.負(fù)模式

A.正模式 B.負(fù)模式

A.正模式 B.負(fù)模式

表2 潛在生物標(biāo)志物鑒定結(jié)果

3.3 芪參益氣滴丸對(duì)心肌梗死治療作用的代謝組學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)以代謝組學(xué)為分析手段，以大鼠血液中的所有小分子代謝產(chǎn)物為分析對(duì)象，從整體上考查芪參益氣滴丸對(duì)心肌梗死的干預(yù)效果。圖4為正常對(duì)照組、模型組和給藥組大鼠血漿的PLS-DA得分圖，分析發(fā)現(xiàn)，在正、負(fù)兩個(gè)模式下，給藥組大鼠的整體狀態(tài)都開始偏離模型組而靠近正常對(duì)照組，說明芪參益氣滴丸給藥后對(duì)心肌梗死大鼠起到了很好的治療作用，血漿中的大部分內(nèi)源性小分子化合物同正常組比較沒有明顯差別。另外，通過分析各個(gè)生物標(biāo)記物的峰面積，發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸給藥干預(yù)后能使標(biāo)記物發(fā)生逆轉(zhuǎn)而趨于正常。由此可見，芪參益氣滴丸可以通過調(diào)節(jié)心肌梗死大鼠的磷脂代謝、能量代謝和脂肪酸代謝及炎癥反應(yīng)來起到顯著的治療作用。

A.正模式 B：負(fù)模式

4 討論

代謝組學(xué)是通過考查生物體系受刺激或擾動(dòng)前后所有小分子代謝物及其含量的變化，或其動(dòng)態(tài)變化，來研究生物體系的一門科學(xué)[4,5]。代謝組學(xué)中所研究的代謝物是指生物肌體的代謝中間體和產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸、碳水化合物、色素、芳香酸、甾醇等初級(jí)和次生代謝產(chǎn)物。其研究對(duì)象包括整個(gè)生物體、尿液、血液、組織、組織提取物和細(xì)胞等[6]。代謝組學(xué)在疾病診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)、藥物藥效安全性評(píng)價(jià)、病理學(xué)研究及營(yíng)養(yǎng)代謝研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。由于代謝組學(xué)強(qiáng)調(diào)研究的整體性，對(duì)生物體的整體擾動(dòng)進(jìn)行研究和探討，因此其理論核心和中醫(yī)中藥的整體協(xié)同作用的基礎(chǔ)一致。由于近幾年分析技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)處理方法的更新，使得代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)中藥研究領(lǐng)域得以廣泛的應(yīng)用，進(jìn)而使中醫(yī)藥這種復(fù)雜體系對(duì)生命體復(fù)雜體系干擾的作用途徑得以較清楚的揭示。目前，已有多個(gè)療效顯著的中藥復(fù)方進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，并取得了較好效果[7]。

本研究采用大鼠心臟冠脈左前降支結(jié)扎造心肌缺血模型，芪參益氣滴丸給藥干預(yù)后，以代謝組學(xué)為分析手段，通過對(duì)大鼠血液的聚類分析發(fā)現(xiàn)模型組的硬脂酰甘油磷脂酰膽堿、溶血磷脂膽堿、磷脂酰乙醇胺等代謝水平下調(diào)，涉及能量代謝、磷脂代謝及脂肪酸代謝、炎癥變化等相關(guān)代謝通路，說明心肌梗死與這些通路的變化密切相關(guān)。

能量代謝障礙是心臟病重要的病理生理環(huán)節(jié)，心肌的能量來源于血液中游離脂肪酸和碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。冠脈結(jié)扎后，大鼠缺血心肌內(nèi)的ATP會(huì)明顯減低，此時(shí)心肌內(nèi)酰基輔酶A合成酶(CoAS)的活性顯著降低，會(huì)導(dǎo)致游離脂肪酸和磷脂代謝的紊亂[8]。本實(shí)驗(yàn)鑒定出的心肌梗死潛在生物標(biāo)志物中，有眾多磷脂類的物質(zhì)，如溶血磷脂膽堿(LPC C20:4)、溶血磷脂膽堿(LPC C18:1)和溶血磷脂膽堿(LPC C18:0)，這說明磷脂代謝紊亂很可能是造成缺血損傷后心肌梗死代謝異常的主要原因。

在心肌梗死發(fā)生后，磷脂酶活化，促使花生四烯酸在缺血心肌的聚集，導(dǎo)致花生四烯酸代謝產(chǎn)物相應(yīng)增加[9]。花生四烯酸經(jīng)環(huán)加氧酶前列腺素G2(PGG2)、前列腺素H2(PGH2)、前列腺素E2(PGE2)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為血栓烷A2(TXA2)、血栓烷B2(TXB2)，PGE2等能夠誘發(fā)炎癥、促進(jìn)局部血管擴(kuò)張，TXA2及PGE2能促進(jìn)血小板凝集、血管收縮，促進(jìn)凝血和血栓的形成，造成一系列嚴(yán)重的心血管疾病?；ㄉ南┧岬拇x異常對(duì)心臟的正常功能有著極大的影響，可導(dǎo)致心臟的收縮力下降，心輸出量減少，甚至可誘發(fā)或加重心肌梗死和心絞痛[10]，很有可能是缺血損傷后心肌梗死發(fā)生的重要機(jī)制之一。

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2 Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. “Metabonomics”: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica, 1999, 29(11): 1181-1189

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4 German J B, Roberts M A, Fay L,etal. Metabolomics and individual metabolic assessment: the next great challenge for nutrition[J]. J Nutr, 2002, 132(9):2486-2487

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2015-09-18

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*通訊作者：穆殿平，E-mail：ping_md0208@163.com。