口腔黏膜扁平苔蘚中Bax蛋白表達(dá)和血漿神經(jīng)肽Y濃度的研究

苗國(guó)英，栗志英，李桂英

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論著·臨床

口腔黏膜扁平苔蘚中Bax蛋白表達(dá)和血漿神經(jīng)肽Y濃度的研究

苗國(guó)英，栗志英，李桂英

目的 探討口腔扁平苔蘚(OLP)黏膜Bax蛋白的表達(dá)和血漿神經(jīng)肽Y(NPY)濃度及其相互間的關(guān)系。方法 選擇2011年3月—2013年10月確診的口腔扁平苔蘚患者38例為觀察組，正?？谇火つふ?2例為對(duì)照組。應(yīng)用免疫組化染色技術(shù)對(duì)2組口腔黏膜組織進(jìn)行Bax蛋白表達(dá)的檢測(cè)，應(yīng)用神經(jīng)肽放射免疫法測(cè)定NPY的濃度。結(jié)果 觀察組中斑紋型、糜爛型Bax陽(yáng)性率、指數(shù)均高于對(duì)照組(χ2=12.16、22.29；t=8.71、15.38，P<0.01)；糜爛型Bax指數(shù)高于斑紋型(t=4.52，P<0.01)。斑紋型、糜爛型NPY濃度均高于對(duì)照組(t=4.91、7.46，P<0.01)；糜爛型高于斑紋型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.18，P<0.05)。結(jié)論 Bax蛋白與NPY在OLP中均呈高水平，高濃度NPY可促進(jìn)T細(xì)胞活化，Bax蛋白又通過(guò)活化的T細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞凋亡而參與OLP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

扁平苔蘚，口腔；Bax蛋白；血漿神經(jīng)肽Y

扁平苔蘚(lichen planus,LP)是一種發(fā)生于皮膚、毛囊、黏膜的瘙癢性、炎性反應(yīng)性疾病，約占皮膚科門(mén)診病例的1.0%～1.5%[1]。口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)是一種病因不甚清楚，發(fā)生在口腔黏膜的慢性或亞急性淺表性炎性反應(yīng)性疾病，發(fā)病率約占LP的50%左右，有0.4%～5.6%的惡變率，世界衛(wèi)生組織將其歸為癌前狀態(tài)[2]。探討OLP如何從正常細(xì)胞惡變?yōu)槟[瘤細(xì)胞或細(xì)胞異常增殖一直是學(xué)界研究的難點(diǎn)。隨著分子生物技術(shù)、免疫學(xué)、基因?qū)W的發(fā)展，關(guān)于OLP機(jī)制的研究越加深入，目前對(duì)于OLP發(fā)病機(jī)制的探討主要集中在細(xì)胞免疫中的T淋巴細(xì)胞激活及其細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化標(biāo)志物以及神經(jīng)精神因素4個(gè)方面。有學(xué)者認(rèn)為，OLP是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，其中特異性T淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化、應(yīng)答、T細(xì)胞亞群分布的特異性，以及T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用在OLP發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[3]。目前關(guān)于本病的單方面機(jī)制研究較多，現(xiàn)從細(xì)胞凋亡與神經(jīng)因素兩方面交互探索OLP的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年3月—2013年10月于我院口腔門(mén)診就診患者32例作為對(duì)照組，組織標(biāo)本為正?？谇火つぃ鋪?lái)源于患者行智齒拔除術(shù)時(shí)分離牙齦切取，或切齦的健康組織，或系帶手術(shù)所切的黏膜組織，黏膜完整、無(wú)炎性反應(yīng)。其中男18例，女14例，年齡18～37(29.56±5.22)歲。OLP標(biāo)本來(lái)自于我院同期口腔就診的38例OLP患者，其中男22例，女16例，年齡19～36(28.33±5.72)歲。斑紋型扁平苔蘚17例，糜爛型扁平苔蘚21例，組織標(biāo)本均在治療前活檢取用。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)診斷標(biāo)準(zhǔn)： 參閱2012年中華口腔學(xué)會(huì)口腔黏膜病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)、中華口腔學(xué)會(huì)中西醫(yī)結(jié)合專(zhuān)業(yè)委員會(huì)制定的“口腔扁平苔蘚診療指南(試行)”[4]。臨床表現(xiàn)：局部病變呈粟粒狀白色或白灰色丘疹，針尖大小，可形成威肯線，白色條紋病變可組成環(huán)狀、斑塊狀、網(wǎng)狀等，與正常黏膜無(wú)清晰界限，病損處可有充血、糜爛、潰瘍、紅斑、水皰等。病理診斷：棘層增生或萎縮，上皮過(guò)度或不全角化，上皮釘突呈鋸齒狀，固有層淋巴細(xì)胞帶狀浸潤(rùn)，基底層角質(zhì)形成細(xì)胞損傷，基膜與基底層角質(zhì)形成細(xì)胞連接成分，或可見(jiàn)棘層、基層紅染膠樣小體；在免疫熒光法中可見(jiàn)基底膜區(qū)后網(wǎng)狀熒光。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：其他自身免疫性疾病、系統(tǒng)性疾病、涎腺疾病、牙周病、其他黏膜疾病、腫瘤；就診3個(gè)月進(jìn)行過(guò)相關(guān)治療。

1.3 苔蘚組織Bax蛋白測(cè)定與判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 Bax蛋白測(cè)定方法： 苔蘚組織標(biāo)本切取后均置于10%甲醛中固定24 h，組織取材厚度為3 mm，做石蠟包埋制成目標(biāo)蠟塊，做5 μm厚的組織切片(德國(guó)Leica RM2135石蠟切片機(jī))。免疫組化染色采用DAKO公司的Envision顯色系統(tǒng)，具體步驟如下：二甲苯I、II各20 min，降序濃度(100%～70%)酒精使切片水化；預(yù)處理組織切片，蒸餾水漂洗后放于TBS中；阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，漂洗后于TBS中10 min；一抗[兔抗人Bax多克隆抗體(廈門(mén)博欣生物技術(shù)有限公司)]孵育30 min于37℃，TBS漂洗10 min；將多聚體Envision+TM孵育37℃，30 min，TBS漂洗10 min；DAB(采用現(xiàn)配現(xiàn)用，在蒸餾水1～1.5ml中依次加入20×TBS、20×DAB、20×H2O2液各1滴，避光混勻)顯色，于光鏡下觀察。試劑盒檢測(cè)批內(nèi)變異系數(shù)<10%，批次間變異系數(shù)<15%。

1.3.2 判定標(biāo)準(zhǔn)： 觀察者為有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師，采用雙盲觀察計(jì)數(shù)法，在400倍光鏡下，對(duì)免疫組化染色后的標(biāo)本進(jìn)行Bax的計(jì)數(shù)觀察。每張切片選擇5個(gè)陽(yáng)性染色最明顯的視野計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)≥500個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的比例，取5個(gè)視野的平均數(shù)作為該標(biāo)本的最終計(jì)數(shù)結(jié)果。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色范圍、程度、分布進(jìn)行判定，細(xì)胞漿棕黃色為陽(yáng)性，不著色為陰性。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%；1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>5%且<20%，著色為淡棕黃色；2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)20%～50%，著色為中棕黃色；3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%且<80%，著色為深棕黃色；4分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥80%。細(xì)胞計(jì)數(shù)+著色=指數(shù)。指數(shù)總分0分為陰性(-)，1～2分者為弱陽(yáng)性(+)，3～4分者為陽(yáng)性(++)，>4分者為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 血漿神經(jīng)肽Y(NPY)放射免疫測(cè)定： ACS180 SE全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(德國(guó)拜耳)。入選者于清晨空腹時(shí)，取肘靜脈血3 ml于抗凝試管中，并加入10%EDTA二鈉40 μl與抑肽酶60 μl，混勻后離心(2 000 r/min，10 min)，分離，吸取上層血漿注入EP試管中密封，放置于-25℃環(huán)境中儲(chǔ)存以備檢測(cè)。NPY檢測(cè)操作：取血漿、標(biāo)準(zhǔn)液各0.2 ml，加抗血清，混勻，在4℃環(huán)境中放置48 h，之后加入125I-NPY，混勻，4℃放置12 h，加入分離劑，分離結(jié)合與游離的125I-NPY。應(yīng)用SN-695B型全自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器(上海原子核研究所日環(huán)儀器廠)測(cè)定沉淀物“cpm”值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算B/Bo百分比計(jì)算血漿NPY免疫活性物質(zhì)濃度[5]。NPY試劑盒由解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心免疫所提供。

2 結(jié) 果

2.1 Bax表達(dá) 本組病例中未見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性者。陽(yáng)性率比較：對(duì)照組低于觀察組的斑紋型、糜爛型(χ2=12.16、22.29，P<0.01)，斑紋型與糜爛型差異不顯著(χ2=1.28，P=0.26)。指數(shù)比較：對(duì)照組低于斑紋型、糜爛型(t=8.71、15.38，P<0.01)；斑紋型低于糜爛型(t=4.52，P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 NPY表達(dá) 與對(duì)照組NPY濃度(120.63±26.33)pg/ml比較，斑紋型(160.33±28.14)pg/ml、糜爛型(179.63±26.36)pg/ml升高(t=4.91、7.46，P<0.01)，且NPY濃度糜爛型高于斑紋型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.18，P<0.05)。

表1 2組Bax的表達(dá)情況

3 討 論

細(xì)胞凋亡(cell apoptosis)又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD)，是由基因控制的機(jī)體維持正常生理功能及內(nèi)環(huán)境平衡的重要過(guò)程，是一種不同于細(xì)胞壞死的，具有一定形態(tài)、生化特征的細(xì)胞自主性死亡過(guò)程[6]。關(guān)于PCD的機(jī)制研究較深入，目前認(rèn)為其傳導(dǎo)通路主要是內(nèi)源性線粒體依賴(lài)途徑，即由細(xì)胞內(nèi)或外信號(hào)啟動(dòng)；或細(xì)胞在受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，通過(guò)死亡受體途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。Bcl-2基因家族是PCD過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子，其中Bax、Bcl-xs、Bad等是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子；Bcl-2、Bcl-xL、Mcl2等則是抑制細(xì)胞凋亡的因子。有學(xué)者用Bcl-2基因蛋白產(chǎn)物及其單克隆免疫沉淀法發(fā)現(xiàn)了Bax蛋白，該蛋白與Bcl-2蛋白具有21%的同源性，其中BH3區(qū)域具有拮抗凋亡抑制蛋白的作用，并通過(guò)線粒體與Bcl-2交互作用，發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用[8]。本次研究我們應(yīng)用的Envision顯色系統(tǒng)將二抗和酶在一個(gè)葡聚糖大分子上標(biāo)記，使傳統(tǒng)的二抗和三抗(酶)連接在一起，形成復(fù)合物Envision，避開(kāi)了生物素與鏈親和素的結(jié)合，是一種兩步免疫組化法。該法不受內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性強(qiáng)，背景低，對(duì)Bax具有較好的觀察。從本觀察情況來(lái)看，Bax主要位于基底層和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)的角質(zhì)形成細(xì)胞的包漿中，少有散在表皮各處者。從染色結(jié)果來(lái)看，對(duì)照組Bax的陽(yáng)性率、指數(shù)均明顯低于觀察組，提示LP皮損部Bax具有高表達(dá)，說(shuō)明細(xì)胞凋亡參與了LP的發(fā)生過(guò)程。Bax具有一個(gè)跨膜位點(diǎn)存在于線粒體上，因此線粒體介導(dǎo)是Bax實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的主要途徑。Bax形成自身同源二聚體作為細(xì)胞色素C通過(guò)線粒體進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用，或與Bcl-2蛋白結(jié)合成異源二聚體抑制Bcl-2蛋白，或與Bcl-2競(jìng)爭(zhēng)，均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9]。角質(zhì)形成細(xì)胞Bax表達(dá)越多說(shuō)明細(xì)胞凋亡情況越嚴(yán)重。范媛等[10]對(duì)比口腔白斑、LP、口腔鱗癌的Bax表達(dá)水平時(shí)認(rèn)為，Bax在LP糜爛型的陽(yáng)性率為80%，非糜爛型為66%，兩者差異不顯著，故Bax的過(guò)度表達(dá)在LP癌變的參與度上有待進(jìn)一步研究。從Bax陽(yáng)性率來(lái)看，本次試驗(yàn)與范媛的結(jié)果一致，由于觀察病例數(shù)有限，比率的對(duì)比差異不夠靈敏，因此我們對(duì)Bax染色指數(shù)進(jìn)行了糜爛型與斑紋型的對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明糜爛型的細(xì)胞凋亡程度較高，惡變傾向較大。葉建英等[11]對(duì)64例老年OLP進(jìn)行臨床觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)出，糜爛型惡變率占20.83%，非糜爛型中未見(jiàn)惡變者。

綜上所述，OLP的發(fā)生、發(fā)展與免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系均密切，感覺(jué)神經(jīng)的異常刺激會(huì)促使NPY水平升高，繼發(fā)T細(xì)胞活化，導(dǎo)致Bax的過(guò)表達(dá)引發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。那么，在臨床治療OLP時(shí)應(yīng)注意對(duì)患者情緒的調(diào)節(jié)，監(jiān)測(cè)Bax與NPY水平，對(duì)疾病發(fā)展做出積極應(yīng)對(duì)。在下一步的研究中，我們將引入神經(jīng)因素的觀察以便更好地探索NPY與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，進(jìn)一步研究OLP的機(jī)制，為從神經(jīng)系統(tǒng)入手防治該病的發(fā)生、發(fā)展提供更多思路。

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Study on the expression of plasma cellular apoptosis protein Bax and neuropeptide Y in oral lichenplanus

MIAOGuoying,LIZhiying,LIGuiying.DepartmentofDermatology,AffiliatedHospitalofHebeiUniversityofEngineering,Handan056029 ,China

Objective To investigate the expression of Bax protein in oral lichenplanus (OLP) mucosa and the relationship between the expression of plasma neuropeptide Y (NPY).Methods From 2011 March to 2013 October, 38 cases diagnosed of oral lichenplanus were enrolled as the observation group, 32 cases normal oral mucosa as the control group. The expression of Bax protein in oral mucosa tissues was detected by immunohistochemical staining, and the concentrations of NPY were determined by neuropeptide radioimmunoassay.Results Observation group’s reticular oral lichen,erosive oral lichen’s Bax protein positive rate and index were higher than those of the control group (χ2=12.16,χ2=22.29;t=8.71,t=15.38,P<0.01); erosive oral lichen’s Bax index higher than the reticular oral lichen type (t=4.52,P<0.01). Reticular oral lichen, erosive oral lichen’s NPY concentrations were higher than those of control group (t=4.91,t=7.46,P<0.01); erosive oral lichen type was higher than that of the reticular oral lichen type, the difference was statistically significant (t=2.18,P<0.05).Conclusion Bax protein and NPY in OLP showed a high level and high concentrations of NPY can promote the activation of T cells, Bax protein by activated T cells, causing cell apoptosis in OLP occurrence and development process.

Lichenplanus,oral;Bax protein;Plasma neuropeptide Y

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.10276105D-63)； 河北省邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃 資助項(xiàng)目(No.200510904-2)

056029 邯鄲，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.06.017

2015-02-12)