心臟成纖維細(xì)胞瞬時(shí)受體電位通道的研究進(jìn)展

孫義潤綜述 王德國，王安才審校

綜 述

心臟成纖維細(xì)胞瞬時(shí)受體電位通道的研究進(jìn)展

孫義潤綜述 王德國，王安才審校

瞬時(shí)受體電位通道；心肌纖維化；心臟纖維細(xì)胞；鈣離子通透通道；TRP通道亞型

心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)在心臟中數(shù)量最多，病理狀態(tài)下CFs增殖遷移到損傷局部并活化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts, MFs)，其表型和功能發(fā)生顯著改變，特征性表現(xiàn)為瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential,TRP)通道的表達(dá)水平升高，合成和分泌膠原蛋白功能劇增。在心臟纖維化的進(jìn)程中，TRP通道高度表達(dá)于CFs和MFs，誘導(dǎo)和加強(qiáng)心肌纖維化的級聯(lián)瀑布的發(fā)生，這與TRP通道的獨(dú)特性質(zhì)密切相關(guān)，隨著研究的深入，潛在的TRP通道很可能成為抗纖維化治療的新靶點(diǎn)[1，2]。

1 TRP通道的結(jié)構(gòu)和功能屬性

TRP通道是非特異性陽離子通道，構(gòu)成成員眾多，目前有超過30個(gè)TRP通道家族成員在哺乳動物實(shí)驗(yàn)中被克隆，基于哺乳動物基因序列同源性，哺乳動物TRP通道大家族被分為6種亞型，在既往的研究中發(fā)現(xiàn)它們高度表達(dá)于心肌纖維細(xì)胞中，參與纖維化級聯(lián)瀑布的誘導(dǎo)和加強(qiáng)，具有以下獨(dú)特性質(zhì)：鈣離子通透、非電壓門控屬性及激活的機(jī)制多種多樣，使其在調(diào)控心肌纖維化過程中發(fā)揮的作用全面而強(qiáng)大，第一個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得的TRP通道基因是在果蠅上克隆的，在針對哺乳動物體TRP通道的不斷研究中，越來越多的TRP通道家族成員被發(fā)現(xiàn)，但它們本身具有明顯的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性，擁有一個(gè)共同的結(jié)構(gòu)，包含6次跨膜蛋白，其N末端和C末端均在胞內(nèi)，并由第五和第六次跨膜結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成非選擇性陽離子通道[3]。由于不像其他電壓門控離子通道，TRP通道在S4區(qū)缺乏一個(gè)完整的帶電氨基酸，鑄就了其鈣離子的非選擇性。基于哺乳動物基因序列同源性，哺乳動物TRP通道大家族被分為6種亞型，包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML，標(biāo)準(zhǔn)的TRPC通道包含7個(gè)成員(TRPC1～7)，以異聚體的形式存在并形成功能通道，例如：TRPC1/TRPC4/TRPC5或者TRPC3/TRPC6/TRPC7；TRPC通道是鈣離子非選擇性陽離子通道，高度表達(dá)于心肌CFs、MFs中，大多數(shù)TRPC通道可由Gq-linked受體激活，其中TRPC3和TRPC6也能被DAG激活。TRPV亞型包含6個(gè)成員(TRPV1～6),主要是被有害的內(nèi)環(huán)境活化。變異的亞型TRPM包括8個(gè)成員(TRPM1～8)，其中TRPM2、TRPM6和TRPM7不僅有通道功能而且C末端有酶切功能，TRPPA、TRPP和TRPML家族則是以細(xì)胞內(nèi)的離子通道形式存在[4]。綜上所述TRP通道可被許多因素調(diào)節(jié)，包括心肌損傷、氧化應(yīng)激、機(jī)械應(yīng)力及炎性反應(yīng)刺激、溫度、滲透壓、pH值以及一些內(nèi)外源性配體和自分泌和旁分泌相關(guān)細(xì)胞因子(TGFβ1、PDGF、CTGF、ET-1、AngII)等，此外Gq-linked受體、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高等也可使其活化，甚至一些TRP通道表現(xiàn)為本身結(jié)構(gòu)活躍。由于TRP通道具備以下獨(dú)特性質(zhì)：鈣離子通透、非電壓門控屬性及激活的機(jī)制多種多樣，使TRP通道成為調(diào)控鈣離子進(jìn)入心肌成纖維細(xì)胞的最佳選擇[5]。

多個(gè)信號通路和生物活性分子可以激活CFs,誘導(dǎo)CFs、MFs發(fā)生級聯(lián)瀑布，導(dǎo)致ECM沉積和纖維化的形成，其中CFs上TRP離子通道作為眾多生物活性分子的靶點(diǎn)，調(diào)控整個(gè)纖維化進(jìn)程，最終誘發(fā)心臟纖維化與各種形式的心臟疾病,包括心肌病、心力衰竭和心律失常(圖1)[6]。

圖1 多信號通路和生物活性分子激活CFS、MFS發(fā)生級聯(lián)瀑布

2 TRP通道介導(dǎo)纖維化機(jī)制

2.1 CFs的膜電位屬性 近期的研究表明CFs的靜息膜電位對CFs的電生理學(xué)特性具有深遠(yuǎn)的影響，它不僅能夠影響刺激—釋放偶聯(lián)、CFs到MFs的轉(zhuǎn)化，甚至對CFs與CFs之間細(xì)肌絲的聯(lián)動能力也產(chǎn)生重大影響。雖然心肌細(xì)胞的靜息膜電位通常約-80 mV，已處于相對活躍的狀態(tài)，但CFs有更加活躍的靜息膜電位，使用傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)微電極記錄法，記錄到的原位心臟纖維細(xì)胞的靜息膜電位處于-31～-16 mV之間，而利用最新的膜片鉗技術(shù)記錄游離大鼠的心房成纖維細(xì)胞的靜息膜電位是-37 mV，但仍不能明確定位哪一種離子通道最終決定心臟成纖維細(xì)胞的靜息膜電位[7，8]。在國內(nèi)外的前瞻研究中指出，由Kir 2.1基因編碼的內(nèi)向整流鉀通道很可能導(dǎo)致靜息膜電位的發(fā)生，然而內(nèi)向整流鉀通道只被記錄在MFs上出現(xiàn)卻未在CFs上發(fā)現(xiàn)，因此仍需要進(jìn)一步研究了解心臟CFs的靜息膜電位決定因素[9]。

研究表明，電壓依賴性Na+和K+通道已經(jīng)被證實(shí)存在于CFs，此外一過性外向鉀離子電流(Ito)以及其他2種類型的延遲整流鉀離子電流也已經(jīng)被證實(shí)存在于大鼠的心室CFs,盡管這幾種K+通道的詳細(xì)的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)尚不清楚，但利用免疫印跡分析技術(shù)檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法證實(shí)Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5和Kv2.1 α-亞基參與編碼上述K+通道的蛋白結(jié)構(gòu)[10]。此外經(jīng)過國內(nèi)外數(shù)個(gè)科學(xué)團(tuán)隊(duì)的研究，電壓門控鈉通道，非電壓門控的K+和Cl-通道，K+電流激活的Ca2+相關(guān)通道都相繼證明存在于MFs上，其編碼基因也已經(jīng)被逐漸找到，其中Ca2+電流相關(guān)通道的參與纖維化發(fā)生逐漸被重視[11]。

2.2 CFs上TRP通道的發(fā)現(xiàn)之旅 在心臟組織研究中，TRP通道的基因表達(dá)很容易通過RT-PCR技術(shù)檢測到。曾經(jīng)很多國內(nèi)外學(xué)者對于檢測標(biāo)本的可靠性表示質(zhì)疑，提出實(shí)驗(yàn)使用的心臟組織標(biāo)本除了富含纖維細(xì)胞外，心肌細(xì)胞及其他類型的細(xì)胞成分所占比例也較高，經(jīng)過近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，使用分離提純的纖維細(xì)胞和培養(yǎng)的纖維細(xì)胞,通過TR-PCR技術(shù)，各種TRP通道的表達(dá)也逐漸被證實(shí)[12]。Berridge等[13]報(bào)道稱在新鮮分離的人類心房成纖維細(xì)胞中，TRPC1、TRPC6、TRPV2、TRPV4和TRPM7很容易被發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人類心肌纖維細(xì)胞，TRPC1、TRPC4和TRPC6在mRNA水平也呈現(xiàn)高表達(dá)。除此之外，在大鼠的心肌纖維細(xì)胞中，TRPC1、TRPC3、TRPC4、TRPC6、TRPV2、TRPV4、TRPM4、TRPM6及TRPM7也通過RT-PCR技術(shù)被發(fā)現(xiàn)，但通過電生理技術(shù)觀測上述離子通道難度還很大，僅有小部分在實(shí)驗(yàn)階段[14]。

通過電生理技術(shù)，在心肌纖維細(xì)胞中第一個(gè)被記錄的TRP通道是TRPM7。在心肌纖維組織中表達(dá)很豐富，是人類和大鼠心臟纖維細(xì)胞中最主要的Ca2+通道介導(dǎo)CFs和MFs細(xì)胞內(nèi)外Ca2+電流的分布。Sukumaran等[15]證實(shí)并記錄了TRPM7通道電流的存在，而且這種非選擇性陽離子通道可以被c-利鈉肽(c-ANP)引出，證實(shí)TRPM7是一個(gè)獨(dú)特的陽離子通道，具有蛋白激酶功能，本身結(jié)構(gòu)較活躍，在生理?xiàng)l件下對Ca2+和Mg2+通透，產(chǎn)生小的內(nèi)向電流，在心肌成纖維細(xì)胞中是最主要的Ca2+通透通道之一，實(shí)驗(yàn)中通過抑制TRPM7通道相關(guān)Ca2+電流可對纖維化的進(jìn)程有明顯的控制作用，除此之外，Nilius等[16]對TRP大家族的通道電流也做了很全面的電生理學(xué)分析，TRPC3、TRPC6、TRPV4、TRPM2也逐漸通過電生理技術(shù)被記錄，進(jìn)一步證實(shí)TRP大家族的Ca2+電流的通透屬性在心肌纖維化的級聯(lián)瀑布中，發(fā)揮重要的作用。

2.3 CFs上TRP通道相關(guān)Ca2+信號對纖維化影響的研究 Ca2+信號是廣泛存在的細(xì)胞內(nèi)第二信使，廣泛的參與信號傳導(dǎo)，對各種細(xì)胞功能是必不可少的，包括酶和激素分泌、基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞凋亡，因此對于細(xì)胞內(nèi)外Ca2+分布的研究越來越多[17]。在針對細(xì)胞表面離子通道的研究中，由于TRP通道具有較小的電導(dǎo)，可長時(shí)程地傳遞Ca2+信號，所以TRP通道相關(guān)的Ca2+信號作用越來越突出。有研究[18]證明進(jìn)出CFs細(xì)胞膜的Ca2+信號對細(xì)胞內(nèi)部Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放有觸發(fā)作用，Ca2+電流越強(qiáng)，誘發(fā)的CFs纖維化級聯(lián)瀑布越劇烈，在不同種類的心臟標(biāo)本中，通過雙盲對照，特異性阻滯相應(yīng)的不同亞型的TRP通道，可明顯減少進(jìn)出細(xì)胞膜的Ca2+，說明進(jìn)入細(xì)胞膜的Ca2+電流可通過TRP通道調(diào)控。纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix proteins ,ECM)的過度累積造成，其本身由CFs和它的分化類型MFs合成，在正常情況下，CFs是靜止的，獲得病理性的刺激增殖活化為MFs，且MFs能夠產(chǎn)生較CFs兩倍多的ECM，因此由CFs轉(zhuǎn)化為MFs是心臟纖維化的級聯(lián)瀑布中關(guān)鍵的一步,關(guān)鍵的一步在各種生物研究中由TRP通道介導(dǎo)的Ca2+信號介導(dǎo)的證據(jù)越來越充分[19]。成纖維細(xì)胞在生理情況下是靜態(tài)的，針對病理學(xué)的刺激，如心肌損傷、氧化應(yīng)激、機(jī)械牽拉、自分泌和旁分泌介質(zhì)水平的升高，炎性刺激，多個(gè)信號通道和多種生物活性分子共同作用激活CFs，導(dǎo)致CFs增殖、遷移、分化成MFs，細(xì)胞因子和生長因子的合成與釋放，組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的合成和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉淀，從而導(dǎo)致心臟纖維化的發(fā)生。此外ECM的降解酶主要是MMPs[20]。MMPs也是一組Ca2+依賴的蛋白酶家族,Ca2+位于酶的活性中心部位, 對酶的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)是MMPs的特異性阻斷因子, 二者都由纖維細(xì)胞合成分泌, ECM 降解與沉積的平衡就由MMPs/TIMP 的比例維持,Ca2+就是此平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高則平衡向右移[21]。

3 TRP通道介導(dǎo)心臟纖維化的危害

3.1 心臟疾病中的纖維化 纖維化代表著過度的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉淀。心臟纖維化是阻礙心肌重塑的最基本組成部分，對于心臟功能而言，不僅導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)異常，心室壁硬化，減少收縮和舒張的整體性能，最終導(dǎo)致各種心臟疾病包括：心肌肥大、心力衰竭、心律失常等[22]。

3.2 纖維化在缺血性心臟病中的研究 纖維化在缺血性心肌病中對阻礙心肌重塑導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性失敗發(fā)揮著重要的作用，由于慢性動脈疾病，在缺血性心肌病的晚期，表現(xiàn)為節(jié)段性的膠原蛋白累計(jì)為主并最終導(dǎo)致心臟衰竭，其中間質(zhì)纖維化平均占左右心室的28%和13%[23]。最新實(shí)驗(yàn)研究表明，在心肌梗死部位，血管緊張素II和血管緊張素I型受體迅速增加，其中血管緊張素受體高度定位于巨噬細(xì)胞和心肌梗死部位，此外轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ1和I型膠原蛋白也被發(fā)現(xiàn)在梗死部位高表達(dá)，這都?xì)w因于在心肌梗死部位及其附近邊緣地區(qū)大量CFs和MFs的增長。以自分泌和旁分泌的方式，CFs和MFs產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子對TGFβ1進(jìn)行正調(diào)節(jié)，進(jìn)而增加膠原蛋白的產(chǎn)生。在壞死區(qū)域的心肌細(xì)胞梗死后被纖維化和梗死瘢痕所取代，正常的心肌細(xì)胞往往也被間質(zhì)纖維化損壞。由上述一系列反應(yīng)過程，梗死瘢痕和間質(zhì)纖維化最終導(dǎo)致受損部位的傳導(dǎo)、收縮和舒張功能下降[24]。

3.3 纖維化在心律失常中的研究 在最常見的持續(xù)性心律失常的臨床模型里，房顫模型是纖維化致結(jié)構(gòu)重塑誘發(fā)心律失常的特征性模型。已經(jīng)證實(shí)大量的纖維組織逐漸增加出現(xiàn)在已知可識別心臟病伴發(fā)的房顫或單純性房顫患者的心肌組織中。在動物房顫模型中，通過藥物誘導(dǎo)纖維化獲得房顫過程中，大鼠表現(xiàn)出顯著的心房間質(zhì)纖維化而心室大小和組織結(jié)構(gòu)卻正常，其動作電位屬性和級聯(lián)蛋白中也未發(fā)現(xiàn)任何異常，這表明僅僅纖維化就可能導(dǎo)致房顫。在人的房顫模型中也獲得了類似的結(jié)果[25]。除此之外，纖維化的數(shù)量或范圍與房顫的發(fā)生率呈正相關(guān)也已被證實(shí)，表明不管是動物模型數(shù)據(jù)還是房顫患者的數(shù)據(jù)都提示纖維化本身能夠提高房顫發(fā)生率。

3.4 纖維化在心力衰竭中的研究 在心力衰竭中纖維化是絕對的不利因素，在高血壓性心臟病誘發(fā)心力衰竭模型中，纖維化的程度和面積與病變心臟的重量息息相關(guān)。在模型中的纖維組織證實(shí)主要是由I型膠原蛋白和少量的II型膠原蛋白組成。在心臟標(biāo)本中，纖維組織的抗拉強(qiáng)度甚至可與鋼相提并論，以至于使舒張期心室壁非常僵硬，難以再填充。在動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)纖維化治療的轉(zhuǎn)歸與ACEI類藥物關(guān)系密切，規(guī)范化治療甚至可以逆轉(zhuǎn)左心室僵硬[26]。臨床研究中，患者接受雷米普利規(guī)范化治療還演示了ACEI類藥物能夠降低循環(huán)中I型膠原蛋白和II型膠原蛋白的水平/濃度，此外利用超聲心動圖評估用藥前后舒張期充盈情況也提示有明顯的好轉(zhuǎn)。這種逆轉(zhuǎn)纖維化的藥理干預(yù)表明，抗纖維化治療可以通過減少心臟纖維化的程度來延緩心力衰竭。

4 小結(jié)

纖維化的基本病理過程包括纖維組織過度增殖、異常凋亡以及ECM 過量沉積，這一過程改變了組織器官原有的正常結(jié)構(gòu), 引起其功能的相應(yīng)改變。纖維細(xì)胞膜上存在著與其增殖、凋亡以及ECM 合成、分泌和降解有密切關(guān)系的Ca2+通道(TRP),在心臟疾病中，纖維化的重要角色已經(jīng)眾所周知，然而卻很少有有效的方法針對纖維化相關(guān)性疾病進(jìn)行臨床干預(yù)，這就強(qiáng)調(diào)需要對纖維化的潛在機(jī)制有新的見解和思路，從而為抗纖維化藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。本文重點(diǎn)闡述TRP通道介導(dǎo)Ca2+信號在心肌纖維化級聯(lián)瀑布中調(diào)節(jié)CFs和MFs發(fā)揮的重要作用，其次在理論上為抗纖維化藥物提供藥物作用靶點(diǎn)(潛在的TRP通道)。

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241000 蕪湖，安徽省弋磯山醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科

王安才，E-mail:yjswac@sina.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.031

2015-05-27)