VOC增溶菌的發(fā)酵培養(yǎng)及增溶作用研究*

王國惠，許亞楠

(中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州510275)

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VOC增溶菌的發(fā)酵培養(yǎng)及增溶作用研究*

王國惠，許亞楠

(中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州510275)

選擇苯和甲苯作為VOCs代表成分，以增溶活性和乳化率作為指標(biāo)，研究增溶微生物的發(fā)酵條件、BST產(chǎn)生規(guī)律及增溶效果等。結(jié)果表明，成功馴化產(chǎn)BST的增溶微生物。其最適發(fā)酵條件是：碳源質(zhì)量濃度1.0 g/L，初始pH值6.95～7.05，溫度范圍26～32 ℃。增溶菌具有明顯的產(chǎn)BST規(guī)律：在0～36 h內(nèi)持續(xù)快速增加，36 h時，產(chǎn)生量最大。發(fā)酵液對苯和甲苯具有良好的增溶效果，分別是純培養(yǎng)基的2.7倍和30倍。苯與BST所形成的乳滴為水包油，易溶于水，有利于VOCs的生物降解。產(chǎn)BST的細(xì)菌大都是G-短桿菌。

VOCs；生物增溶；苯；甲苯

VOCs因排放量大、種類多、毒性強(qiáng)已成為全球關(guān)注的焦點[1]。目前已鑒定的VOCs達(dá)300多種，最常見的是苯、甲苯、二甲苯、三氯甲烷等。苯已被世界衛(wèi)生組織列為強(qiáng)致癌物[2]。VOCs處理方法很多，包括冷凝法、吸收法、吸附法和膜分離法、催化燃燒法、等離子體法、光催化氧化法及生物法等[3-8]。目前應(yīng)用較多是吸附法、催化燃燒法和生物法。前兩種方法成本高，給治理企業(yè)帶來了很大負(fù)擔(dān)。生物法操作簡單、成本低、無二次污染備受青睞[9-12]。然而，由于VOCs水溶性差，導(dǎo)致其可生化性偏低，故限制了該技術(shù)的應(yīng)用[13]。

提高VOCs可生化性的重要途徑就是對其增溶。表面活性劑對VOCs具有良好的增溶作用。利用表面活性劑提高疏水性有機(jī)污染物的溶解性已有展開，但大多利用的是化學(xué)表面活性劑。而化學(xué)表面活性劑具有毒性且難降解，易引起二次污染。生物表面活性劑(簡稱BST)不僅具有良好的表面活性和乳化性能[14]，且具無毒、易于生物降解等獨特優(yōu)勢，使其在VOCs生物治理方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究針對VOCs水溶性差影響其生物降解問題，馴化VOCs增溶微生物，使其產(chǎn)BST。利用BST使VOCs增溶。本研究選擇苯和甲苯作為VOC的代表進(jìn)行實驗。

為了滿足實際工程的需要，直接用發(fā)酵液對VOC進(jìn)行增溶，不僅降低生產(chǎn)成本，且發(fā)酵液完成增溶后還將為下一步降解微生物帶來營養(yǎng)。本研究建立一個完全開放式的自然發(fā)酵體系，可為BST的大批量生產(chǎn)提供技術(shù)支持。通過本研究，有望突破VOC因難溶于水而影響其生物降解這一瓶頸，為VOCs的高效生物處理提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

搖床(SUKUN SKY-211，上海蘇坤)、干燥箱(DHG-9240A，上海申賢)、電子天平(FA2204，上海安亭)、滅菌器(LS-B50L)、培養(yǎng)箱(SGSP-02 黃石恒豐)、超凈臺(SW-CJ-1D，蘇州凈化)、水浴鍋(HH-4)、離心機(jī)(TDZ5-WS，長沙平凡)、pH計(DELTA 320)、氣泵、流量計及液相色譜儀(日本島津)等。

1.2 主要試劑

苯(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、甲苯(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、蘇丹紅Ⅲ((分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、甲醇(色譜純，廣州化學(xué)試劑廠)。

1.3 培養(yǎng)基

硫酸銨5 g/L ，廢石油20 g/L，葡萄糖1.0 g/L，氯化鉀1.0 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，pH 7～7.5，自來水1 L。

1.4 種源樣品

樣品來自某污水處理池。

2 實驗方法

2.1 增溶菌的馴化

2.1.1 搖床馴化 在無菌條件下，于500 mL三角瓶中加入200 mL滅菌培養(yǎng)基，污泥按一定比例接入，搖床馴化。

2.1.2 擴(kuò)大培養(yǎng) 于2.5 L用紗布封口的廣口瓶中加入1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基，高壓滅菌。在無菌條件下，按一定比例轉(zhuǎn)接馴化種液，曝氣培養(yǎng)。按同樣方法，進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接。逐漸由無菌接種變?yōu)樽匀唤臃N，再過渡到完全開放式自然培養(yǎng)。設(shè)對照組。

2.2 增溶活性指標(biāo)及測定方法

實驗時先用液態(tài)苯及液態(tài)甲苯進(jìn)行驗證。

2.2.1 增溶能力及測定方法 取一直徑為9 cm平皿，加入20 mL去離子水，然后在水面上緩慢滴加2 mL染色苯或染色甲苯，待形成穩(wěn)定薄膜后，在薄膜中心滴加1 mL離心后的發(fā)酵液。發(fā)酵液若能增加苯或染色甲苯在水中的“溶解”，便形成一圓圈，即增溶圈。測量增溶圈直徑。每組設(shè)3個平行，取其平均值。染色苯和染色甲苯是苯和甲苯分別用蘇丹紅Ⅲ染色而成的。

2.2.2 乳化能力及測定方法 苯或甲苯與發(fā)酵液按一定比例作用，若發(fā)酵液中有BST的產(chǎn)生，則二者即可形成乳化層。乳化能力以乳化百分率(EI)衡量。乳化百分率的計算

其中，Hem為乳化層高度，cm；Hoi為苯層高度，cm。

2.3 乳化液乳化性質(zhì)的鑒別

乳狀液兩類型[15]：一類是水包油型(O/W)；另一類是油包水型(W/O)。為了提高鑒別的準(zhǔn)確性，分別用親油性染料(蘇丹紅Ⅲ)和親水性染料(沙黃和結(jié)晶紫)對乳狀液進(jìn)行染色。用蘇丹紅Ⅲ染色的乳狀液若整體為紅色，則為W/O型；若僅乳滴為紅色，則為W/O型。用沙黃或結(jié)晶紫染色的乳狀液若整體為紅色或紫色，則為O/W型；若僅乳滴為紅色或紫色，則為W/O型。

2.4 增溶實驗

2.4.1 增溶實驗方法 實驗系統(tǒng)由氣泵、吸收瓶、氣體混合瓶、流量計及增溶瓶等通過膠管連接而成。增溶瓶有兩個。一個裝發(fā)酵液，為增溶實驗瓶；另一個裝空白培養(yǎng)基，為對照瓶。

實驗所用苯及甲苯為氣態(tài)苯及甲苯。氣態(tài)苯及甲苯采用吹脫法配制。氣泵將空氣分別鼓入裝有液態(tài)二苯的吸收瓶和氣體混合瓶。通入吸收瓶中的空氣將氣態(tài)二苯載入混合瓶，與空氣按一定比例充分混合后分別被送入增溶瓶和對照瓶中?；旌蠚怏w的流量由流量計控制，保證通入增溶瓶的流量(16 L/h)相等。連續(xù)6 h后停止通氣，靜止6 h，共持續(xù)12 h，取樣，每1 h取樣一次。

2.4.2 增溶率的測定 增溶率的測定采用高效液相色譜法測定“溶解”態(tài)苯的濃度。具體方法如下：

(1)色譜條件。流動相甲醇水溶液，配比為V(甲醇)/V(水)=80/20，檢測器SPD-20AV、色譜柱SHIMADZU VP-ODS C18、流速0.8 mL/min、柱溫40 ℃、檢測波長260 nm。

(2)增溶率(IS)的計算。增溶率(IS)為苯及甲苯在發(fā)酵液中的最大“溶解度”(Sf)與苯及甲苯在空白發(fā)酵培養(yǎng)基中的“溶解度”(Sc)之差與Sc的比值，為無量綱量。氣態(tài)苯與甲苯增溶率的計算公式為

其中，Sf與Sc的單位為g/L。

實驗所測得的溶解度為氣態(tài)苯及甲苯的表觀溶解度。因此，用表觀溶解度計算所得到的增溶率為表觀增溶率。實驗中用表觀增溶率來衡量發(fā)酵液中BST對氣態(tài)苯的增溶效果。

通氣過程中定時測定發(fā)酵液對氣態(tài)苯及甲苯的“溶解量”及停止通氣后發(fā)酵液中苯及甲苯的溶解量。以時間為橫坐標(biāo)，以發(fā)酵液中“溶解”態(tài)苯及甲苯的含量為縱坐標(biāo)，繪制溶解量隨時間的變化曲線，確定發(fā)酵液對苯與甲苯的增溶穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與分析

3.1 搖床馴化結(jié)果

3.1.1 葡萄糖質(zhì)量濃度對馴化效果的影響 設(shè)葡萄糖質(zhì)量濃度為0、 0.5、1.5和2.0 g/L，其他條件不變，通過增溶能力和乳化能力，確定最佳葡萄糖質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源濃度對馴化效果的影響Fig.1 Effect of concentration of carbon source on acclimation effect

由圖1可知，當(dāng)ρ(葡萄糖)為0 g/L時，增溶直徑和乳化率都為0，說明發(fā)酵液沒有BST的產(chǎn)生。當(dāng)ρ(葡萄糖)分別為0.5、1.5和2.0 g/L時，發(fā)酵液都有BST的產(chǎn)生，但含量都偏低。當(dāng)ρ(葡萄糖)為1.0 g/L時，增溶直徑和乳化率都最大，即發(fā)酵液中BST含量最高。因此，發(fā)酵液最佳葡萄糖質(zhì)量濃度確定為1.0 g/L。

以上結(jié)果表明，BST的產(chǎn)生需要一定糖類物質(zhì)。廢石油是碳源，但不是唯一碳源，還需糖類碳源的幫助。廢石油起到的可能是刺激或誘導(dǎo)作用，在被微生物利用的同時，刺激其產(chǎn)BST。

3.1.3 初始pH值對馴化效果的影響 取葡萄糖質(zhì)量濃度為1.0 g/L，將初始pH值設(shè)為6.65、6.75、6.85、6.95、7.05、7.15、7.25和7.35，通過測定發(fā)酵液的增溶能力和乳化能力，確定最佳初始pH。結(jié)果見圖2。

圖2 初始pH值對馴化效果的影響Fig.2 Effect of different initial pH on acclimation effect

由圖2可知，初始pH值在6.95～7.05之間時，發(fā)酵液的增溶直徑和乳化率都相對比較高。高于或低于此范圍，增溶直徑和乳化率都將減小。由此確定，發(fā)酵最佳初始pH值在6.95～7.05之間。

3.1.3 溫度對馴化效果的影響 在最適碳源濃度、最適初始pH值條件下，將搖床溫度分別設(shè)20、22、24、26、28、30、32、34和36 ℃，通過測定發(fā)酵液的增溶能力和乳化能力，確定其最佳馴化溫度。結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對馴化效果的影響Fig.3 Effect of temperature on acclimation effect

由3可知，馴化溫度在26～32 ℃時，BST釋放量最大，高于或低于此范圍，增溶直徑和乳化率都將減小。故確定發(fā)酵最佳溫度范圍為26～32 ℃。

3.2 擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)果

3.2.1 BST產(chǎn)生規(guī)律 通過測定發(fā)酵液對苯和甲苯的增溶活性，得到BST產(chǎn)生隨時間的變化規(guī)律(圖4)。

圖4 BST產(chǎn)生曲線Fig.4 Release curves of BST

由圖4可見，接種12 h內(nèi)，發(fā)酵液對苯和甲苯的增溶活性明顯增加。這說明增溶菌對新環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。自接種至36 h，發(fā)酵液對兩種苯的增溶與乳化一直呈快速增加的趨勢，36 h后緩慢下降。BST產(chǎn)生規(guī)律的研究對實際生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義，可依據(jù)該規(guī)律，確定發(fā)酵周期。

3.2.2 發(fā)酵液增溶效果

(1)發(fā)酵液對苯的增溶效果。通過前面的實驗，已證明BST對液態(tài)苯及甲苯有優(yōu)良的增溶及乳化能力，但實際生產(chǎn)時，被處理的VOCs成分為氣態(tài)形式。為了進(jìn)一步證明BST對VOCs的增溶作用，即提高氣態(tài)苯類在水相中的“溶解度”，對其進(jìn)行了增溶實驗。結(jié)果見圖5。

圖5 氣態(tài)苯增溶曲線Fig.5 Solubilization curves of gaseous benzene

由圖5可知，連續(xù)通氣1 h后，苯在發(fā)酵液中的“溶解”量約為1.67 g/L；苯在空白培養(yǎng)基的質(zhì)量濃度只有0.7 g/L。此后繼續(xù)通氣，兩種溶液中苯的含量都在增加。通氣4～6 h，發(fā)酵液中苯的質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，達(dá) 2.0 g/L。6 h后停止通氣時，空白培養(yǎng)基中苯的質(zhì)量濃度僅為0.9 g/L，而發(fā)酵液中苯的質(zhì)量濃度一直在1.8 g/L以上。在隨后的6 h中，空白培養(yǎng)基中的苯一直在減少，平均揮發(fā)速率約為0.064 g·L-1·h-1，而發(fā)酵液中苯的質(zhì)量濃度維持在約2 g/L。

由此可見，在通氣過程中，發(fā)酵液對苯有明顯的“溶解”效果，且較穩(wěn)定。發(fā)酵液的表觀溶解度達(dá)空白培養(yǎng)基的2.7倍。可見BST對氣態(tài)苯具有良好而穩(wěn)定的增溶效果。

(2)發(fā)酵液對甲苯的增溶效果(圖6)。從圖6可見，甲苯在純培養(yǎng)基中的表觀溶解度只有0.004 7～0.007 0 g/L。但在發(fā)酵液中，甲苯的質(zhì)量濃度在通氣開始時為0.11 g/L，表觀增溶量是空白培養(yǎng)基的9倍。隨著甲苯氣體的持續(xù)通入，其在發(fā)酵液中的量不斷增加。通氣0～3 h時，發(fā)酵液對甲苯的表觀增溶率達(dá)空白培養(yǎng)液的27倍。隨著時間的延長，空白培養(yǎng)基中的甲苯持續(xù)揮發(fā)，發(fā)酵液中甲苯含量比較穩(wěn)定，說明BST能與甲苯穩(wěn)定地結(jié)合在一起。在12 h時，發(fā)酵液的表觀增溶量為空白培養(yǎng)基的30倍。可見發(fā)酵液對氣態(tài)甲苯也具有理想的增溶效果。

圖6 氣態(tài)甲苯增溶曲線Fig.6 Solubilization curves of gaseous toluene

3.3 乳化類型鑒定

發(fā)酵液與苯和甲苯的乳化類型鑒定結(jié)果是：用蘇丹紅Ⅲ染色時，整體未被染色，染料與分散相不能互溶,而乳滴被染為紅色。初步判定乳化層為O/W型。用沙黃和結(jié)晶紫染色時，整體分別被染成了紅色和紫色，進(jìn)一步證明乳化層為O/W型。

水包油的“殼”外層親水，故可與水相混。本實驗中苯與BST所形成的乳滴為水包油，故易溶于水。這對苯類及其VOCs的生物降解是極為有利的。

3.4 增溶菌的初步鑒定結(jié)果

出于生產(chǎn)應(yīng)用的考慮，本研究所馴化的增溶菌非單一純種。通過革蘭氏染色與顯微觀察，大都為革蘭氏陰性短桿菌。相關(guān)內(nèi)容將進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

成功馴化獲得了產(chǎn)BST的微生物，確定了產(chǎn)BST的最適條件。BST具有明顯的產(chǎn)生規(guī)律，約 36 h時產(chǎn)生量最大。馴化所得到的BST對苯與甲苯都具有良好的增溶效果，發(fā)酵液對苯的表觀“溶解度”為空白培養(yǎng)基的2.7倍。在12 h時，發(fā)酵液對甲苯的表觀增溶量為空白培養(yǎng)基的30倍。苯和甲苯與BST所形成的乳滴為水包油，易溶于水，這有利于苯類及其VOCs的生物降解。產(chǎn)BST的細(xì)菌大都是G-短桿菌。

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The Fermentation Culture of VOCs Solubilization Microorganisms and Its Solubilization

WANGGuohui，XUYanan

(School of Enviromental Sciences and Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275,China)

To improve the water-solubility and biodegradability of VOCs, VOCs solubilization microorganisms were domesticated to make its produce biosurfactant to make VOC solubilize. Benzene and toluene were selected as representative composition,such as solubilization activity and emulsifying rate as index, the fermentation conditions, production regularity and solubilization effect of microorganisms of VOCs solubilization etc were studied. The result showed that the solubilization microorganisms that produce BST were successfully domesticated. The optimum fermentation conditions for the production of BST was that the best carbon source concentration was 1.0 g/L and the optimal initial pH value was in the range of 6.95～7.05 and the optimum temperature range was in the range of 26～32 ℃. The solubilization bacteria had an obvious regularity for production of BST. The BST continue to increased rapidly during the fermentation of 0～36 h, and arrived at a maximum yield at 36 h. The fermentation liquid had good effect on the solubilization of benzene and xylene. The fermentation liquid had good effect on the solubilization of benzene and xylene. They were 2.7 times and 30 times of the pure medium, respectively. The emulsion droplets formed by benzene and BST were as an oil in water and it is soluble in water. This was more favorable for the biodegradation of VOCs. The bacteria producing BST were mostly gram negative bacilli. The BST was initially identified as a polysaccharide. The content of BST in the fermentation broth was about 60 g/L.

VOCs; biosolubilization; benzene; toluene

10.13471/j.cnki.acta.snus.2015.05.017

2015-07-20

廣東省科技計劃資助項目(2013B020600005)；廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合資助項目(2012B091100318)；廣州市科技計劃資助項目(2014J4100093)；廣州市2013年污染防治新技術(shù)、新工藝開發(fā)資助項目

王國惠(1962年生)，女；研究方向：廢氣生物治理;E-mail:1761424972@qq.com

X512

A

0529-6579(2015)05-0085-05