高 艷，占日新，劉麗麗，陳芳輝，李宙雪，張 盈，孔 瀅，黃起壬

(南昌大學藥學系藥理學與分子治療學實驗室，江西南昌 330006)

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員，包括3種亞型:PPARα、PPARβ 和 PPARγ［1］。其中 PPARγ 與脂肪細胞分化、胰島素抵抗、能量代謝和胰島素的敏感性密切相關(guān)，表達于成纖維細胞、平滑肌細胞、乳腺細胞、脾臟的紅白髓質(zhì)、骨髓前體細胞、單核細胞和巨噬細胞、肺泡及氣道上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞等細胞中［2－3］。關(guān)于PPARγ改善機體胰島素敏感性的機制研究，一直是人們關(guān)注的熱點之一。美國加州大學和瑞士洛桑聯(lián)邦理工學院的研究表明，敲除實驗鼠脂肪細胞內(nèi)核受體共抑制因子(NCoR)可改善胰島素敏感性。NCoR存在于很多細胞中，是轉(zhuǎn)錄因子輔助調(diào)節(jié)蛋白，是主要的PPARγ的共抑制因子。敲除實驗鼠脂肪細胞內(nèi)NCoR后，PPARγ磷酸化受阻，最后導(dǎo)致肝臟、肌肉和脂肪胰島素敏感性增加［4－5］。本實驗擬構(gòu)建針對PPARγ基因的短發(fā)夾環(huán)狀小干擾RNA(shRNA)重組載體，并將其轉(zhuǎn)染到人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)，篩選出抑制效果最好的重組表達載體，為進一步研究PPARγ低表達對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮胰島素抵抗及其敏感性的作用及機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌種與細胞株pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒購自上海吉瑪公司;脂質(zhì)體為LipofectamineTM2000;人臍靜脈內(nèi)皮細胞株購自ATCC。

1.2工具酶及主要試劑限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和BamHⅠ購自美國NEB公司;限制性內(nèi)切酶PstⅠ購自Promega公司;T4連接酶和DNA Marker購自TaKaRa公司;質(zhì)粒小提試劑盒和DNA膠回收純化試劑盒購自Qiagen公司;Top10感受態(tài)細胞購自天根公司;DMEM培養(yǎng)基干粉購自Invitrogen公司;特級胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司;Kanamycin購自Sigma公司;PPARγ多克隆抗體及HRP標記的二抗購自Cell Signaling公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3引物設(shè)計及合成利用GenBank檢索人PPARγ mRNA系列(GenBank Accession:NM_138712)，根據(jù)siRNA設(shè)計原則，通過Ambion公司在線設(shè)計軟件輔助設(shè)計，使用Blast將選定的序列進行同源性分析，最后選出3條片段作為PPARγ基因干擾片段，設(shè)計shRNA模板中的 loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用TTTTTT結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的5'端添加了CACC與BbsⅠ酶切后形成的黏端互補;反義鏈模板的5'端添加了GATC與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補;如果siRNA的第1個堿基不是G，則在CACC后補加個G。將合成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)寡核苷酸單鏈用無核酶水稀釋為濃度0.46 mmol·L－1。按照以下體系退火得到shRNA模板:1 μl正義鏈、1 μl反義鏈、48 μl TE(pH 8.0)共50 μl在PCR儀上按照如下程序進行退火處理:90 ℃ 4 min，80 ℃ 4 min，75 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，37℃ 20 min，10℃ 40 min，4℃保存。將退火后產(chǎn)物稀釋20倍，終濃度為 0.92 μmol·L－1用于連接反應(yīng)。

1.4酶切和連接反應(yīng)pGPU6/GFP/Neo載體按如下反應(yīng)體系進行雙酶切:10 × NEB buffer 2 μl、100 × BSA 0.2 μl、pGPU6/GFP/Neo 1 μg、Bbs Ⅰ 0.8 μl、Bam HⅠ 0.5 μl、加無核酶水至20 μl，37℃酶切3 h。1%TAE瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒回收。將退火片段與經(jīng)雙酶切后的載體按摩爾比4∶1進行連接反應(yīng)，置16℃連接16 h。

1.5重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定將連接產(chǎn)物接種于Top10感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，涂布到3 ml含Kanamycin(終濃度為4.62 μmol·L－1)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜，各挑取2個菌落，接種到含4.62 μmol·L－1Kanamycin的LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜。用質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用PstⅠ和BamHⅠ分別酶切鑒定。得到的重組質(zhì)粒分別命名pGPU6/GFP/Neo-shRNAPPARγ1，2，3。將初步鑒定證實的細菌擴增培養(yǎng)，取1 ml菌液送天根生化科技(北京)有限公司進行測序鑒定，測序引物為T7，測序方向為正向測序。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs取處于對數(shù)生長期的HUVECs，用胰酶消化后使用含血清和不含抗生素的正常培養(yǎng)基重懸為2×108～8×108個·L－1后，接種至6孔培養(yǎng)板上，待細胞生長至70% ～80%匯合時進行轉(zhuǎn)染。LipofectamineTM2000試劑和質(zhì)粒比例為 10 μl∶4 μg，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，6 h后換成高糖培養(yǎng)基(33 mmol·L－1)。轉(zhuǎn)染24 h時后熒光顯微鏡下觀察HUVECs綠色熒光的表達情況，觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。實驗分為空白對照組(Control組)、高糖組(IR組)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(IR+Non-silencing shRNA組)和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(IR+shRNAPPARγ 1，2，3 組)，每組重復(fù)3次。

1.7Western blot檢測PPARγ基因的蛋白表達轉(zhuǎn)染48 h后提取HUVECs總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。上樣量為40μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，PVDF膜印跡，室溫10%脫脂牛奶封閉2 h，加入PPARγ一抗(1∶500)孵育過夜，辣根過氧化物酶HRP標記的二抗孵育2 h，ECL化學發(fā)光顯色，X線片顯影、定影。ImageTool圖像分析軟件測定各條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照進行數(shù)據(jù)分析，計算抑制率，抑制率/%=(對照組－干擾組)/對照組×100%。

1.8統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，所得數(shù)值以±s表示。

2 結(jié)果

2.1引物設(shè)計及合成根據(jù)siRNA設(shè)計原則，通過Ambion公司在線設(shè)計軟件輔助設(shè)計3條片段作為PPARγ基因干擾片段(Tab 1)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

Tab 1 Design there shRNA sequence for the synthesis of PPARγ gene

2.2重組質(zhì)粒酶切鑒定用PstⅠ和BamHI分別酶切重組載體，質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo的BamHⅠ和BbsⅠ酶切位點之間是PstⅠ的酶切位點;插入目的基因干擾片段之后，PstⅠ酶切位點被取代，故不能被PstⅠ所酶切，但可被BamHⅠ酶切開，條帶在5 100 bp左右(Fig 1)。

Fig 1 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pGPU6/GFP/Neo

2.3重組質(zhì)粒測序鑒定將篩選克隆送天根生化科技(北京)有限公司測序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒測序鑒定shRNA編碼序列與設(shè)計的片段完全一致，表明載體構(gòu)建成功(Fig 2)。

Fig 2 The sequencing result of recombinant plasmid of pGPU6/GFP/Neo-PPARγ-1，2，3

2.4重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率因為干擾質(zhì)粒帶有EGFP片段，進入細胞后可以產(chǎn)生能被激發(fā)出綠色熒光的蛋白，所以可以據(jù)此判斷轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率/%=發(fā)出綠色熒光的細胞個數(shù)/明場中總細胞個數(shù)×100%，轉(zhuǎn)染效率為45%(Fig 3)。

Fig 3 Fluorescence microscope restructuring recombinant plasmid transfected HUVECs(×100)

2.5重組質(zhì)粒中PPARγ蛋白的表達Western blot檢測結(jié)果顯示(Fig 4)，IR組與Control組相比差異具有顯著性(P＜0.01);IR組和Non-silencing shRNA組間相比無差異(P＞0.05);shRNAPPARγ1和shRNAPPARγ2組與IR組相比無差異(P＞0.05)，無干擾效應(yīng);shRNAPPARγ3組與IR組相比差異有顯著性(P＜0.05)，說明轉(zhuǎn)入 PPARγshRNAPPARγ3后，抑制了PPARγ基因的表達，使PPARγ蛋白在高糖誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄生成減少。

Fig 4 Western blot control to detect the expression of PPARγ protein

3 討論

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)是類固醇/甲狀腺素核受體超家族成員之一，與NF-κB及活化劑蛋白-1(AP-1)等因子關(guān)系密切［6－7］。PPARγ可在體內(nèi)體外調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和細胞分化，在脂肪形成、糖脂代謝及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并且與糖尿病、肥胖、高血壓、癌癥等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但是在血管內(nèi)皮細胞中PPARγ對胰島素抵抗的作用機制還未完全闡明。

胰島素抵抗是指胰島素的靶器官對生理濃度的胰島素反應(yīng)減弱，是2型糖尿病的重要發(fā)病因素。胰島素抵抗是代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)，PPARγ對糖代謝的調(diào)節(jié)主要是增加外周組織對胰島素的敏感性，從而改善胰島素抵抗［8］。有研究表明［9］，PPARγ功能受損會導(dǎo)致嚴重的胰島素抵抗，而合成的PPARγ激動劑噻唑烷二酮類藥物包括曲格列酮(troglitazone)、羅格列酮、吡格列酮可以有效改善2型糖尿病患者的胰島素敏感性并降低血糖。PPARγ增加胰島素敏感性的機制可能是:磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是靶細胞介導(dǎo)葡萄糖進入細胞內(nèi)的關(guān)鍵性激酶，PPARγ在PI3K信號通路中可以促進PI3K基因表達，增強胰島素的敏感性，還可增強葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GluT4)基因表達，促進對葡萄糖的攝取［10］;PPARγ活化可以加速甘油三酯在外周組織的分解和抑制轉(zhuǎn)錄因子Pax6的活性，抑制胰高血糖素的生成和表達，改善胰島素抵抗［11］。

RNAi技術(shù)具有快速、高效、便于操作等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用到基因功能研究、基因表達調(diào)控機制研究等熱門領(lǐng)域［12］。本實驗應(yīng)用RNAi技術(shù)，成功構(gòu)建了PPARγ低表達質(zhì)粒，并成功篩選出了沉默效果最好的重組表達載體。為進一步研究PPARγ低表達對高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗及其敏感性的作用及機制奠定了基礎(chǔ)。

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