發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮的提取及含量測(cè)定

張曉崢 邢蓬蕊 張顯香 于 鑫 朱偉偉 楊志孝

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271016)

發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮的提取及含量測(cè)定

張曉崢 邢蓬蕊 張顯香 于 鑫 朱偉偉 楊志孝

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271016)

目的利用超聲法從發(fā)酵豆粕中提取大豆異黃酮，探究出最佳提取條件，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。方法利用微生物發(fā)酵方法對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵處理，通過(guò)超聲及溶劑萃取提取方法提取發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮，進(jìn)而通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)探究出最佳提取條件，利用紫外分光度法測(cè)定含量，并與未發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮含量進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮含量達(dá)到3.27 mg/g，豆粕中含量為1.86 mg/g，大豆中含量為2.59 mg/g。豆粕發(fā)酵后大豆異黃酮的含量顯著提高，是豆粕含量的1.76倍，大豆含量的1.26倍。結(jié)論發(fā)酵豆粕可作為提取大豆異黃酮的良好原料，提高豆粕附加值的同時(shí)可以節(jié)約有限的大豆資源。

發(fā)酵豆粕;大豆異黃酮;超聲提取

我國(guó)大豆年產(chǎn)量約1200萬(wàn)噸，而國(guó)內(nèi)壓榨豆油所用大豆約4000萬(wàn)噸，每年大豆都有巨大的進(jìn)口任務(wù)，由此產(chǎn)生了數(shù)千萬(wàn)噸的豆粕，這些豆粕除少部分用于發(fā)酵醬油、生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白或分離蛋白外，大部分被用作飼料，其中含有的微量生理活性物質(zhì)如大豆異黃酮，絕大部分留在豆粕中而未被利用，造成豆粕資源的極大浪費(fèi)。

大豆異黃酮是存在于大豆中的一種功能性成分，研究表明大豆異黃酮具有防癌、防骨質(zhì)疏松癥［1］、改善婦女更年期癥狀、防心血管之疾等諸多生理功能［2］，目前國(guó)內(nèi)外都已開(kāi)始發(fā)展大豆異黃酮保健品產(chǎn)業(yè)，但當(dāng)前大多以大豆為原料，成本高且提取工序復(fù)雜，而豆粕雖然廉價(jià)易得，卻因其大豆異黃酮的含量低而不受青睞。本研究中創(chuàng)新性地提出以發(fā)酵豆粕為原料，探究出高效簡(jiǎn)便的提取方法，進(jìn)而采用單因素試驗(yàn)就發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期找出最佳的工藝參數(shù)，并與豆粕的大豆異黃酮含量對(duì)比，為以發(fā)酵豆粕為原料生產(chǎn)大豆異黃酮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑納豆芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌TQ.33、曲霉(山東農(nóng)業(yè)大學(xué));染料木素(Gen)標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司)，含量為99.99%;大豆、豆粕(購(gòu)自山東泰安農(nóng)貿(mào)市場(chǎng));乙醚(AR.)，無(wú)水乙醇(AR.)，95%乙醇(AR.)。

1.2 儀器設(shè)備TG332A微量分析天平(上海，精度0.01 mg)、k-30高速冷凍離心機(jī)(sigma公司)、UV-2800紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器公司)、滅手體式蒸汽消毒器(YXQ02型電熱式，山東新華醫(yī)療廠)、凈化工作臺(tái)(YJ-875B，蘇州中亞凈化設(shè)備有限公司)、真空干燥箱(DZF-6210，上海精宏制造廠)、昆山超聲提取器、加樣器(德國(guó)產(chǎn))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 發(fā)酵豆粕的制備挑選優(yōu)質(zhì)大豆，清洗，浸泡6 h。常溫下先接種納豆芽孢桿菌，發(fā)酵，12 h后再接種凝結(jié)芽孢桿菌，接種量為10%，兩菌比例為1: 1，發(fā)酵基質(zhì)中豆粕與麩皮質(zhì)量比為7:3，初始含水量為40%，初始pH值自然，37℃發(fā)酵48 h。干燥備用。

2.2 超聲波提取大豆異黃酮的方法①發(fā)酵豆粕、豆粕分別用攪拌機(jī)打成細(xì)粉。②脫脂處理。用電子分析天平稱(chēng)取發(fā)酵豆粕細(xì)粉5 g，，置于錐形瓶中，按1:10的物料比加入50 ml石油醚，設(shè)定40℃、70 Hz、30 min超聲波震蕩脫脂，倒出提取液后，同樣方法二次脫脂。將兩次提取液用離心機(jī)離心(3000 r/min，3 min)，把沉淀的發(fā)酵豆粕細(xì)粉回收入錐形瓶。將錐形瓶中發(fā)酵豆粕細(xì)粉自然干燥。豆粕的脫脂方法同上。③大豆異黃酮提取條件篩選。為了探究最佳的提取條件，選取與提取效果相關(guān)的若干因素，分別做單因素試驗(yàn)。這些單因素分別是:超聲波提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度。

2.2.1 不同超聲波處理時(shí)間對(duì)大豆異黃酮提取率的影響稱(chēng)取脫脂的發(fā)酵豆粕細(xì)粉5g，在提取溫度為70℃，料液比為1：10，乙醇濃度為95%，超聲波為70 Hz的條件下，分別采用超聲波處理時(shí)間為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h做提取試驗(yàn)，每次試驗(yàn)都用乙醇提取3次，將3次提取液合并，置于離心機(jī)中，離心(3000 r/min，5 min)，取上清液轉(zhuǎn)移到150 ml容量瓶中并用乙醇定容。然后利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量測(cè)定，研究不同超聲波處理時(shí)間對(duì)大豆異黃酮提取得率的影響。

2.2.2 不同提取溫度對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

稱(chēng)取脫脂的發(fā)酵豆粕細(xì)粉5 g，以?xún)?yōu)選的超聲波處理時(shí)間，料液比為1:10，乙醇濃度為95%，70 Hz條件下，分別采用提取溫度為60℃、70℃、80℃、90℃做提取試驗(yàn)，每次試驗(yàn)都用乙醇提取3次，將3次提取液合并，置于離心機(jī)中，離心(3000 r/min，5 min)，取上清液轉(zhuǎn)移到150 ml容量瓶中并用乙醇定容。然后利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量測(cè)定，研究不同提取溫度對(duì)大豆異黃酮提取得率的影響。

2.2.3 不同料液比對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

稱(chēng)取脫脂的發(fā)酵豆粕細(xì)粉5 g，以?xún)?yōu)選的超聲波處理時(shí)間和優(yōu)選的超聲提取溫度，乙醇濃度為95%，70 Hz條件下，分別采取料液比為1：5、1：10、1：15、1：20做提取試驗(yàn)，每次試驗(yàn)都用乙醇提取3次，將3次提取液合并，置于離心機(jī)中，離心(3000 r/min，5min)，取上清液轉(zhuǎn)移到150 ml容量瓶中并用乙醇定容。然后利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量測(cè)定，研究不同料液比對(duì)大豆異黃酮提取得率的影響。

2.2.4 不同乙醇濃度對(duì)大豆異黃酮提取得率的影響稱(chēng)取脫脂的發(fā)酵豆粕細(xì)粉5 g，以?xún)?yōu)選的超聲波處理時(shí)間，優(yōu)選的水提取溫度，優(yōu)選的料液比，分別采用乙醇濃度為70%、80%、95%、100%做提取試驗(yàn)，每次試驗(yàn)都用乙醇提取三次，將三次提取液合并，置于離心機(jī)中，離心(3000 r/min，5 min)，取上清液轉(zhuǎn)移到150 ml容量瓶中并用乙醇定容。然后利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量測(cè)定，研究不同濃度乙醇萃取對(duì)大豆異黃酮提取得率的影響。

2.2.5 大豆異黃酮提取的正交優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了綜合考慮多因素相互作用對(duì)大豆異黃酮提取率的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果采用L9(34)正交設(shè)計(jì)對(duì)大豆多糖提取率的條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)條件見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.3 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及含量測(cè)定

2.3.1 待測(cè)樣品的處理利用單試驗(yàn)及正交試驗(yàn)得到的最佳提取條件，分別提取發(fā)酵豆粕及豆粕中的大豆異黃酮。將兩者提取液各定容至100 ml，各取1000μl置于兩個(gè)10 ml容量瓶中，各用乙醇定容至10 ml，待測(cè)。

2.3.2 大豆異黃酮的測(cè)定條件選擇利用UV-2800紫外分光分光度計(jì)，1 cm石英比色杯，以標(biāo)準(zhǔn)空白溶液調(diào)零后，利用染料木素12 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液、發(fā)酵豆粕、豆粕、大豆樣品提取液，分別在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，其最大吸收波長(zhǎng)均為λmax=265 nm。

2.3.3 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線建立稱(chēng)取染料木素5 mg溶解于5.0 ml無(wú)水乙醇中，得濃度為1.0 mg/ ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分別吸取0、20、40、60、80、100 μl于10 ml容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至10 ml，該系列溶液的濃度分別為0、2、4、6、8、10 μg/ml。利用UV-2800紫外分光分光度計(jì)，選擇λmax=265 nm，以空白溶液調(diào)零后，對(duì)0、2、4、6、8、10 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系類(lèi)溶液進(jìn)行測(cè)定，儀器自動(dòng)以濃度—吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;然后以樣品空白溶液調(diào)零后，直接測(cè)定各樣品溶液大豆異黃酮的濃度(每個(gè)讀數(shù)測(cè)定五次取平均值)，并根據(jù)測(cè)定濃度、樣品體積、樣品質(zhì)量分別計(jì)算出發(fā)酵豆粕、豆粕、大豆中大豆異黃酮的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)大豆異黃酮及樣品紫外區(qū)掃描曲線見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)大豆異黃酮、大豆、豆粕及發(fā)酵豆粕掃描圖譜1.大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)(8μg/ml)2.發(fā)酵豆粕3.黃豆4.豆粕

由圖1可見(jiàn)，在265nm處大豆、豆粕及發(fā)酵豆粕均有與標(biāo)準(zhǔn)大豆異黃酮類(lèi)似的特征吸收，所以可選擇λ265nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線及各樣品大豆異黃酮含量見(jiàn)圖2，表2。

圖2 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

表2 樣品中大豆異黃酮含量

由表2數(shù)據(jù)可得，發(fā)酵豆粕大豆異黃酮提取率是未經(jīng)發(fā)酵豆粕提取率的1.76倍，大豆提取率的1.26倍。發(fā)酵豆粕成本低且大豆異黃酮提取率高，以發(fā)酵豆粕為提取大豆異黃酮原料，既可增加豆粕附加值又可節(jié)約大豆資源，具有廣闊的市場(chǎng)空間。

3.3 大豆異黃酮單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 超聲波處理時(shí)間對(duì)大豆異黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

從圖2可以看出，超聲波處理時(shí)間少于1.5 h時(shí)，處理時(shí)間越長(zhǎng)異黃酮得率越高，1.5 h時(shí)，多糖得率達(dá)到最高;而后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，異黃酮得率開(kāi)始下降。原因可能是超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間的作用會(huì)使破壞異黃酮分子結(jié)構(gòu)，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響異黃酮得率。因此，選取超聲波處理時(shí)間1 h、1.5 h、2.0 h三個(gè)水平進(jìn)行大豆異黃酮提取的正交試驗(yàn)。

3.3.2 提取溫度對(duì)大豆異黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

由圖3可知，從60～90℃，隨著溫度的升高大豆異黃酮的提取得率先增大后減小，因此，選取60℃、70℃、80℃作為溫度的三水平進(jìn)行大豆異黃酮提取的正交試驗(yàn)較為合理。

3.3.3 料液比對(duì)大豆多糖提取得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

由圖4可以看出，料液比在1：5～1：20時(shí)，大豆異黃酮提取率隨料液比的增大而增大;料液比在1：10～1：15時(shí)，大豆異黃酮提取率趨于平緩，同時(shí)因料液比的增大會(huì)增加濃縮的困難，因此，選擇料液比1：10、1：15、1：20三個(gè)水平進(jìn)行大豆異黃酮提取的正交試驗(yàn)。

3.3.4 不同乙醇濃度對(duì)大豆異黃酮提取得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 乙醇濃度對(duì)大豆異黃酮提取率的影響

由圖5可以看出，隨著乙醇濃度的增加，大豆異黃酮提取率增加，95%乙醇與無(wú)水乙醇的提取率近似，因此，選取乙醇濃度為70%、80%、95%三個(gè)水平的乙醇濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.4 大豆異黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3極差分析可知，影響大豆異黃酮提取率各因素主次關(guān)系為:超聲波提取時(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度＞料液比，且分別以第二水平、第三水平、第一水平和第二水平為佳，因此根據(jù)極差結(jié)果，得出大豆異黃酮的最優(yōu)浸提工藝參數(shù)A2B3C1D2，即提取時(shí)間為1.5h、料液比為1:10、乙醇濃度為95%、提取溫度為70℃時(shí)，發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮含提取率最高。

優(yōu)化條件下重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果:從表3可以看出，在正交優(yōu)化條件下做重現(xiàn)性試驗(yàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.151%，小于5%，表明優(yōu)化條件下的可行性和重現(xiàn)性較好，此時(shí)大豆異黃酮提取率達(dá)0.327%。

本研究充分證明了以發(fā)酵豆粕作為大豆異黃酮提取原料的可行性，并且探究出了優(yōu)化的提取工藝，結(jié)合豆粕廉價(jià)易得的特點(diǎn)，利用豆粕發(fā)酵作為大豆異黃酮的提取原料，大大降低了大豆異黃酮的生產(chǎn)成本，節(jié)約了大豆資源，同時(shí)提高了豆粕的附加值。本研究對(duì)豆粕進(jìn)一步加工利用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)促進(jìn)大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

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The extraction and content determination of soybean isoflavonesin in the fermented soybean meal

ZHANG Xiao-zheng XING Peng-rui ZHANG Xian-xiang YU Xin ZHU Wei-wei YANG Zhi-xiao
(Taishan Medical University，Taian 271016，China)

Objective:To extract soybean isoflavones from fermented soybean meal by ultrasonic method，and investigate the best extraction conditions.Methods:Soybean meal was fermented by the method of microorganism fermentation，then ultrasound and solvent extraction method was used to extract soybean isoflavones in soybean meal fermentation.The best extraction conditions were explored through single factor and orthogonal test.Finally，ultraviolet spectrophotometry was used to determine content.Results:The content of soybean isoflavones in the fermented soybean meal was 3.27mg/g，soybean meal＇s content was 1.86mg/g and soybean＇content was 2.59mg/g.Conclusion:Fermented soybean meal can be a good raw material to extract soybean isoflavones，and enhances the additional value of the soybean meal，which can save limited resources of soybean.

fermented soybean meal;soybean isoflavones;ultrasonic extraction

R271.9

A

1004-7115(2015)01-0057-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.01.020

2014-10-17)

山東省青少年科學(xué)研究所項(xiàng)目基金(13DJS072)。

張曉崢(1992-)，女，泰山醫(yī)學(xué)院2010級(jí)臨床醫(yī)學(xué)與英語(yǔ)專(zhuān)業(yè)。

楊志孝，zxyang@tsmc.edu.cn。