線性探針技術(shù)和傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中的可靠性和及時(shí)性對(duì)比

韓珍，林日文，駱妙卡

(惠州市結(jié)核病防治研究所，廣東 惠州516008)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是可造成人類死亡的常見感染性疾病，是全球公共衛(wèi)生面臨的重大威脅[1]。近年來耐藥結(jié)核病的發(fā)病率不斷上升，耐藥結(jié)核病是結(jié)核病控制的難題。TB的早期特異性診斷和及時(shí)治療、及時(shí)切斷傳播鏈并保護(hù)易感人群對(duì)結(jié)核病的治療和預(yù)防具有重要意義[2]。細(xì)菌學(xué)早期診斷是結(jié)核病防治的關(guān)鍵，抗酸染色、羅氏固體培養(yǎng)等傳統(tǒng)TB診斷技術(shù)操作簡單、經(jīng)濟(jì)、方便，易于推廣，但也存在耗時(shí)長、敏感度和特異性差、難以標(biāo)準(zhǔn)化等不足，無法滿足臨床需求[3，4]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，分子線性探針雜交技術(shù)檢測結(jié)核病的臨床應(yīng)用得以推廣[5]。然而目前國內(nèi)外關(guān)于分子線性探針技術(shù)和傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中的可靠性和及時(shí)性分析比較少。本研究比較MTBDR plus技術(shù)和傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)診斷耐藥TB的結(jié)果。準(zhǔn)確性、敏感度、特異度、Kappa值及出報(bào)告所需時(shí)間，為耐藥TB的早期診斷方法的選擇提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 連續(xù)納入2014年1月至10月期間我院收治的246例涂陽肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象。246例患者中男127例，女119例，年齡19~79歲，平均年齡(42.52±8.78)歲，患者均無其他呼吸系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重心肺肝腎功能障礙。

1.2 檢測方法

1.2.1 痰標(biāo)本的收集 每例例涂陽肺結(jié)核患者均留取連續(xù)3d共3份痰標(biāo)本，將獲取標(biāo)本置于4℃冰箱中保存并于留取標(biāo)本3d內(nèi)完成耐藥情況的診斷。痰標(biāo)本的分離和培養(yǎng)均嚴(yán)格按照中國防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》的要求進(jìn)行。

1.2.2 傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn) 對(duì)分離出的菌株進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌菌種進(jìn)行鑒定并進(jìn)行異煙肼和利福平藥敏實(shí)驗(yàn)，菌株鑒定采用對(duì)硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行生長實(shí)驗(yàn)。藥敏實(shí)驗(yàn)參照WHO/IUATLD標(biāo)準(zhǔn)，菌株培養(yǎng)采用中和離心法，使用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的菌落制成1mg/ml的懸液并梯度稀釋為10-2和10-4mg/ml，分別接種于含40μg/ml利福平和0.2μg/ml異煙肼的羅氏固體培養(yǎng)集中。將標(biāo)本置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為6周。培養(yǎng)完成后讀取菌落數(shù)并計(jì)算耐藥百分比，耐藥百分比低于1%為敏感，耐藥百分比高于1%為耐藥，同時(shí)出現(xiàn)異煙肼和利福平耐藥為耐多藥。實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照中國防癆協(xié)會(huì) 《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》要求進(jìn)行，所用培養(yǎng)基均由Basco公司提供。

1.2.3 MTBDR plus線性探針技術(shù)檢測 每例患者均取1份陽性級(jí)別最高的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，檢測試劑盒為德國Hain Life Sciences公司的GenotypeRMTBDR plus試劑盒，具體操作步驟如下：將標(biāo)本進(jìn)行消化后制成重懸液，將500μl重懸液加入離心管內(nèi)5000r/min離心10min后去掉上清液并加入100μl的裂解緩沖液，將重懸液進(jìn)行渦旋震蕩后于95℃水中水浴5min，5000r/min離心 1min后去掉上清液再次加入100μl的裂解緩沖液，將重懸液進(jìn)行渦旋震蕩5s，再次5000r/min離心5min。取上清液5μl加入預(yù)先配置好的PCR擴(kuò)增體系中，擴(kuò)增循環(huán)為95℃擴(kuò)增15min、95℃擴(kuò)增30min、56℃擴(kuò)增 3min，共 10個(gè)循環(huán)；然后 95℃擴(kuò)增 25s、53℃擴(kuò)增 40s、70℃擴(kuò)增 40s，共20個(gè)循環(huán)；最后 70℃擴(kuò)增8min。擴(kuò)增完成后將產(chǎn)物與探針試紙條進(jìn)行雜交，根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥性的判讀。

1.2.4 傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測 檢測方法參照參考文獻(xiàn)[6]，將痰標(biāo)本進(jìn)行去污處理，取0.5μl痰標(biāo)本提取DNA模版進(jìn)行擴(kuò)增加后進(jìn)行耐藥性分析。

1.3 線性雜交技術(shù)結(jié)果判讀 試紙條共27個(gè)反應(yīng)條帶和4各區(qū)域，第1區(qū)為對(duì)照質(zhì)控帶，其他區(qū)為耐藥相關(guān)基因探針區(qū)，其中第2區(qū)是利福平耐藥相關(guān)rpoB基因探針區(qū)，第3、4區(qū)分別為與異煙肼耐藥相關(guān)的KatG、inhA基因探針區(qū)，野生條帶均顯色而突變條帶無顯色時(shí)為敏感，野生條帶缺失和突變條帶顯色或不顯色均為耐藥。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，采用敏感度和特異度對(duì)檢測結(jié)果的真實(shí)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用準(zhǔn)確性對(duì)檢測方法的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用Kappa值分析MTBDR plus技術(shù)、核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果的一致性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)檢測結(jié)果比較 MTBDR plus技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)檢測所得利福平耐藥結(jié)核病發(fā)生率、異煙肼耐藥結(jié)核病發(fā)生率和耐多藥結(jié)核病發(fā)生率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)檢測所得利福平耐藥結(jié)核病發(fā)生率、異煙肼耐藥結(jié)核病發(fā)生率和耐多藥結(jié)核病發(fā)生率則均低于傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)檢測所得結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)檢測結(jié)果比較[n(%)]

2.2 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)診斷耐藥結(jié)核病的準(zhǔn)確性比較 與核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)比較，MTBDR plus技術(shù)檢測利福平耐藥、異煙肼耐藥和耐多藥的敏感度、Kappa值均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、表3和表4。

表2 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)診斷利福平耐藥的準(zhǔn)確性比較

表3 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)診斷異煙肼耐藥的準(zhǔn)確性比較

表4 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)診斷耐多藥的準(zhǔn)確性比較

2.3 MTBDR plus技術(shù)、核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)出報(bào)告時(shí)間比較 MTBDR plus技術(shù)出報(bào)告時(shí)間0.5~2d，平均出報(bào)告時(shí)間為(1.26±0.58)d，核酸擴(kuò)增出報(bào)告時(shí)間 4~15d，平均出報(bào)告時(shí)間為(8.89±1.08)d，MTBDR plus技術(shù)出報(bào)告時(shí)間顯著短于核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)出報(bào)告時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=13.82，P<0.01)。

3 討論

近年來我國耐藥結(jié)核病的發(fā)病率不斷上升，作為全球27個(gè)耐藥結(jié)核病高發(fā)國家之一，我國初診結(jié)核病患者中約5%的患者為耐藥結(jié)核病患者，而復(fù)發(fā)結(jié)核病患者中約1/4的患者為耐藥結(jié)核病患者[7，8]。目前地市級(jí)醫(yī)院由于實(shí)驗(yàn)室診斷能力落后，結(jié)核耐藥診斷報(bào)告往往需數(shù)月時(shí)間，耐藥診斷結(jié)果的滯后性可明顯影響治療效果，耐藥結(jié)核患者無法得到及時(shí)有效的治療且耐藥結(jié)核病的傳播無法得以控制[9,10]。傳統(tǒng)耐藥檢測耗時(shí)長且靈敏性和特異性均較低，無法滿足耐藥結(jié)核病早期準(zhǔn)確診斷的需求[11]。線性探針技術(shù)可通過對(duì)耐藥相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增和反向雜交確定結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性，報(bào)告可于24h內(nèi)獲得，具有快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)[12,13]。國外研究表明，線性探針技術(shù)用于涂陽痰標(biāo)本檢測的敏感度和特異度均較高[14]。2008年世界衛(wèi)生組織亦推薦線性探針技術(shù)可應(yīng)用于低收入國家耐藥結(jié)核病的診斷[15]。然而目前國內(nèi)關(guān)于線性探針技術(shù)診斷結(jié)合耐藥性的可靠性和及時(shí)性的研究報(bào)道甚少。明確線性探針雜交技術(shù)和傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)檢測耐藥結(jié)核病的準(zhǔn)確度和所需時(shí)間可為耐藥結(jié)核病的早期診斷和疾病的控制提供指導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示，分子線性探針雜交技術(shù)檢測所得利福平耐藥結(jié)核病、異煙肼耐藥結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的發(fā)病率與傳統(tǒng)藥敏檢測結(jié)果相近，而傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)檢測所得分子利福平耐藥結(jié)核病、異煙肼耐藥結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的發(fā)病率低于分子線性探針雜交技術(shù)和傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果。傳統(tǒng)基因檢測診斷利福平耐藥結(jié)核病、異煙肼耐藥結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的特異性和準(zhǔn)確性均較高，說明傳統(tǒng)基因檢測在耐藥結(jié)核病的診斷中具有一定價(jià)值，然而其敏感度和Kappa值均較低，傳統(tǒng)基因檢測在耐藥結(jié)核病檢測中的準(zhǔn)確性有待提高。而分子線性探針雜交技術(shù)檢測診斷耐藥結(jié)核病的敏感度、特異性、準(zhǔn)確性及Kappa值均較高，分子線性探針雜交技術(shù)檢測診斷耐藥結(jié)核病具有較好的可靠性。分子線性探針雜交技術(shù)檢測診斷耐藥結(jié)核病出報(bào)告的時(shí)間短，可于2d內(nèi)給出耐藥結(jié)核病診斷報(bào)告，而傳統(tǒng)基因檢測耗時(shí)長，出報(bào)告時(shí)間需約10d，分子線性探針雜交技術(shù)檢測診斷耐藥結(jié)核病具有較高的及時(shí)性。線性探針雜交技術(shù)可通過異煙肼和利福平等耐藥相關(guān)基因的檢測來完成耐藥結(jié)核分枝桿菌的檢測，有助于耐藥TB的早期診斷和及時(shí)治療。由于實(shí)驗(yàn)室檢測受操作人員水平、環(huán)境等多方面因素的影響，因此明確線性探針技術(shù)和傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)在結(jié)核病診斷中的可靠性和及時(shí)性需進(jìn)一步全面深入研究。

綜上所述，分子線性探針技術(shù)較傳統(tǒng)基因檢測技術(shù)可更及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷耐藥結(jié)核病，同時(shí)具有較高的可靠性，是耐藥結(jié)核病診斷的有效方法。

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