超聲波嫩化處理對淘汰蛋鴨中鈣激酶活性影響的研究

秦衛(wèi)東，馬利華，陳學(xué)紅，王嘉俊

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院,江蘇徐州 221000)

超聲波嫩化處理對淘汰蛋鴨中鈣激酶活性影響的研究

秦衛(wèi)東，馬利華，陳學(xué)紅，王嘉俊

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院,江蘇徐州 221000)

采用不同功率及不同處理時間研究了超聲波嫩化淘汰蛋鴨胸肉的效果。結(jié)果表明:超聲波處理可以提高鈣激活酶的活性,通過鈣激活酶對肌原纖維蛋白質(zhì)的水解作用降低肌肉的剪切力。超聲波功率及超聲波處理時間是決定嫩化效果的兩個重要因素。淘汰蛋鴨胸肉最適的超聲波嫩化條件分別為 300W功率、15min處理時間。相關(guān)分析證實鈣激活酶活性與肌肉剪切力之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(R2>0.76)。

淘汰蛋鴨,超聲波,嫩化,鈣激活酶

嫩度是肉類產(chǎn)品的一個重要質(zhì)量指標(biāo),決定肉類嫩度的主要是肌原纖維蛋白和結(jié)締組織,其中結(jié)締組織對嫩度的影響取決于其含量、類型及交聯(lián)程度,特別是結(jié)締組織的交聯(lián)程度隨動物年齡的增大,從而年老動物的肉質(zhì)較年輕者韌性更大。阿部等人[1]比較了2個月的仔雞和淘汰蛋雞的肉質(zhì),確認(rèn)淘汰蛋雞雞腿和雞胸肉的硬度分別比仔雞大29.4%和39.5%,兩部位的總膠原蛋白含量分別高于仔雞,但熱溶性膠原蛋白比例卻低于仔雞。Northcuttt等人[2]指出:仔雞雞胸肉的Warner-Bratzler剪切力仔雞年齡的增加而增加。徐幸蓮等人[3]證實了肉雞和淘汰蛋雞的差別,發(fā)現(xiàn)淘汰蛋雞肌肉的持水功能比肉雞肌肉低,但剪切力顯著地高。因此,淘汰蛋雞在食用或利用之前必須進(jìn)行嫩化處理。

超聲波處理是肉類嫩化的一種新技術(shù),它以兩種方式作用于肉類:一是破壞肌肉細(xì)胞的完整性,二是增強(qiáng)酶促反應(yīng)[4]。已經(jīng)報導(dǎo)了超聲波可以引起肌肉肌節(jié)的擴(kuò)展[5-6]、肌原纖維的崩潰和破碎[6-8]、Z-線區(qū)域微結(jié)構(gòu)的改變[6,9-10]。但未見超聲波處理對肉類內(nèi)源酶,特別是鈣激活酶(calpain)活性影響的報導(dǎo),而肉類的嫩化過程實質(zhì)上是依賴于如pH、離子強(qiáng)度等物理化學(xué)條件的酶促反應(yīng),肌原纖維和肌原纖維相關(guān)蛋白質(zhì)的水解作用通過弱化肌原纖維內(nèi)和肌原纖維間的鍵而使肉類嫩化[11]。一系列的研究表明,鈣依賴性蛋白酶對于肉類的嫩化是必不可少的[12-15]。鈣激活酶催化脂原纖維的降解而使肉的嫩度增大。本研究的目的是探討超聲波嫩化過程中鈣激活酶活性及鴨肉剪切力的變化,確定鈣激活酶活性與鴨肉剪切力的關(guān)系,為超聲波嫩化技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淘汰蛋鴨(20個月齡)由徐州惠農(nóng)鴨業(yè)有限公司提供。蛋鴨宰殺后,取胸肉剔除可見脂肪和結(jié)締組織,實驗前貯藏于-18℃。

Tris、β-巰基乙醇、酪蛋白、EDTA、三氯乙酸 Sigma公司產(chǎn)品；其余化學(xué)試劑 為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

超聲波細(xì)胞粉碎儀 BILON96-Ⅱ型,上海比朗儀器有限公司；勻漿機(jī) ZW-800G,溫州維科生物設(shè)備有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma 3-30K；分光光度計 UV-2600,日本Shimadzu公司；嫩度計:C-LM3B 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波處理 鴨胸肉解凍后,放入塑料袋中,排除空氣后密封。將塑料袋放入加水的燒杯中,置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中,將超聲波探頭(Φ10mm)插入燒杯中,避免探頭與塑料袋接觸。改變超聲波功率或超聲波處理時間,嫩化鴨胸肉。

1.2.2 鈣激活酶的提取 按照Koomaraie[16]描述的程序提取鈣激活酶。簡要地,用3倍體積的含20 mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA和10mmol/L 2-β-巰基乙醇、pH7.5的冰冷緩沖液將鴨肉組織用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理。勻漿液在28000×g離心2 h,上清液用四層的粗棉布和玻璃棉過濾后,將pH調(diào)整到7.5,經(jīng)透析平衡緩沖液(50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA和10mmol/L 2-β-巰基乙醇,pH7.5)透析20h。105000×g離心1h后,立刻上柱(DEAE-Sephacel,流速150mL/h)純化。用5倍的平衡緩沖液沖洗柱子,以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用含0～400mmol/L NaCl 的平衡緩沖液梯度洗脫(每批350mL)。

1.2.3 鈣激活酶活性的測定 以酪蛋白作為底物測定鈣激活酶的活性[16]。取反應(yīng)溶液(100mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,100mmol β-巰基乙醇,0.1mmol/L EDTA,5mmol/L CaCl2,5g/mL 酪蛋白,pH7.5)3mL,加入1mL被分離的稀釋后的該蛋白酶粗酶液,空白為3mL反應(yīng)溶劑(100mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,100mmol β-巰基乙醇,0.1mmol/L EDTA,5mmol/L CaCl2,pH7.5),加入1mL緩沖液B(50mmol/L Tris-HCl,4mmol/L EDTA,pH7.0,1mol/L的醋酸調(diào)節(jié))；對照組為3mL反應(yīng)溶液,加入1mL變性酶液,一般用加熱法,將酶液在100攝氏度沸水浴中加熱5min,上述各反應(yīng)的總體積均為4mL。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行了30min后,加入4mL的5%的TCA終止反應(yīng),TCA溶液的最終濃度為2.5%。然后將反應(yīng)液離心(28000×g,30min),測定上清液的吸光值。

一個酶活性單位被定義為在標(biāo)準(zhǔn)實驗條件下30℃ 30min內(nèi)在280nm下的吸光度增加1.0單位所需的酶的數(shù)量。

1.2.4 剪切力的測定 取適量鴨肉在85℃加熱至中心溫度達(dá)到70℃并保持30min,取出迅速冷至室溫,用吸水紙吸干表面水分后,用直徑1cm的空心取樣器順著肌纖維方向取樣,然后在嫩度計上測定其剪切力值。每個處理樣測定3次,求平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波功率對鴨肉中鈣激活酶活性和肌肉剪切力的影響

不同功率的超聲波功率應(yīng)用于鴨肉嫩化處理的結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲波功率對鴨肉剪切力 和鈣激活酶活性的影響Fig.1 Effect of ultrasound powers on the shear force and calpain activity in duck meat

從圖1可以看出:在300W以內(nèi)的范圍內(nèi),隨著超聲波功率的增大,鴨肉中鈣激活酶活性急劇升高,而肌肉的剪切力幾乎直線下降。繼續(xù)增大功率至400W,酶活性下降,肌肉的剪切力變大。這一結(jié)果與李正英等人報導(dǎo)的超聲波嫩化羊肉的研究結(jié)果[17]相似。他們發(fā)現(xiàn):剪切力隨超聲波功率的增大而快速降低,當(dāng)超聲波功率達(dá)到3.0W/cm2后,繼續(xù)增加超聲波功率時剪切力變化不大。

2.2 超聲波處理時間對鴨肉中鈣激活酶活性和肌肉剪切力的影響

超聲波時間對鴨肉中鈣激活酶活性和肌肉剪切力的影響表現(xiàn)出與超聲波功率相似的變化。即在5～15min范圍內(nèi),鈣激活酶活性急劇增大,剪切力直線下降,在15～25min范圍內(nèi)鈣激活酶活性下降,剪切力升高。Jayasooriya等人[18]報導(dǎo)了在0～60s超聲波處理時牛肉的剪切力有很大程度的下降,但進(jìn)一步延長處理時間,剪切力無顯著變化。Smith等人[19]也曾發(fā)現(xiàn),超聲波處理4min可增加肉類的嫩度,但處理時間延長至8～16min時肉類的嫩度反而降低。本研究的結(jié)果與上述結(jié)論基本一致。

圖2 超聲波處理時間對鴨肉剪切力 和鈣激活酶活性的影響Fig.2 Effect of ultrasound times on the shear force and calpain activity in duck meat

2.3 鴨肉中鈣激活酶活性與肌肉剪切力的相關(guān)分析

對不同超聲波功率嫩化及不同超聲波時間嫩化鴨肉后肌肉中鈣激活酶活性和肌肉剪切力之間進(jìn)行相關(guān)分析,結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 不同超聲波功率嫩化時鴨肉剪切力 與鈣激活酶活性的關(guān)系Fig.3 The relationship between duck meat shear force and calpain activity in tenderization by different ultrasound powers

圖4 不同超聲波處理時間嫩化時鴨肉剪切力 和鈣激活酶活性的關(guān)系Fig.4 The relationship between duck meat shear force and calpain activity in tenderization by different ultrasound treating times

由圖3和圖4可知:超聲波嫩化期間,肌肉中鈣激活酶活性與肌肉的剪切力呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(R2>0.76)。即隨著鈣激活酶活性的增大,肌肉的剪切力存在下降的趨勢。

3 討論

3.1 鴨肉的超聲波嫩化

超聲波嫩化作用一方面是通過超聲波空穴現(xiàn)象對肌肉組織產(chǎn)生物理損害,另一方面則是在損害或弱化肌肉組織的同時導(dǎo)致內(nèi)源酶的激活而促進(jìn)酶解作用[4]。

在較低的超聲波功率(≤300W)或較短的處理時間(5～15min)范圍內(nèi),隨著超聲波功率的增大,產(chǎn)生的空穴效應(yīng)對肌肉組織的物理作用增強(qiáng),有利于鈣離子從細(xì)胞結(jié)構(gòu)中釋放出來,從而激活鈣激活酶。Got等人[5]和Jayasooriya等人[18]均觀察到超聲波處理后肌肉的pH升高,并認(rèn)為這是由于肌肉細(xì)胞中離子釋放出的緣故。Lee等人[20]也認(rèn)為用焦磷酸鈉和氯化鈉注射提高了pH,加速了鈣激活酶的活性,從而改善了肉嫩度。Got等人[5]確認(rèn),超聲波處理后,肌纖維間的空間內(nèi)游離Ca2+增加30%。Koohmaraie等人[21]指出:肌原纖維小片化過程是由Ca2+調(diào)解的,當(dāng)肌肉切片在用含螯合劑(EDTA或EGTA)的緩沖液處理時未觀察到肌原纖維小片化指數(shù)的改變,而當(dāng)在肌肉切片用含CaCl2的緩沖液處理時肌原纖維小片化指數(shù)明顯加速。而當(dāng)肌肉切片單獨用普通緩沖液處理時,肌原纖維小片化指數(shù)的增加量遠(yuǎn)小于未處理的對照肌肉樣品。他們認(rèn)為這種肌原纖維小片化指數(shù)的差異可能是由于大容量的緩沖液稀釋細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。Pohlman等人[22]指出:超聲波作用于肉類可以促進(jìn)增加鈣離子對鈣激活酶的有效性。本實驗中發(fā)現(xiàn)隨著超聲波處理的進(jìn)行,肌肉中鈣激活酶活性增大,從而肌肉的剪切力變小。這一結(jié)果與上述研究和發(fā)現(xiàn)相一致。但當(dāng)進(jìn)一步加大超聲波處理(功率超過300W或時間大于15min)時,鈣激活酶的活性下降,肌肉剪切力增大。這是因為在超聲波作用的同時也會產(chǎn)生一定的熱量[7,18]。Jayasooriya等人[18]確認(rèn)超聲波處理可能導(dǎo)致15～30℃的溫度升高。這種熱效應(yīng)會使肌肉表面產(chǎn)生部分蒸煮[6]。肌肉表面的蒸煮將會導(dǎo)致表面蛋白質(zhì)的變性,不利于Ca2+的釋放,從而鈣激活酶的活性減弱,肌肉硬度增大?；蛘?由于鈣激活酶的最適溫度為25℃左右[23],當(dāng)溫度升高后,鈣激活酶的活性受到抑制。

3.2 鈣激活酶活性與肉類嫩度

人們普遍認(rèn)為肉的嫩化過程本質(zhì)上是酶促反應(yīng)并依賴于pH、離子強(qiáng)度等物理化學(xué)條件。肌原纖維和與肌原纖維相關(guān)蛋白質(zhì)的水解通過弱化肌原纖維內(nèi)和肌原纖維間的鍵而使肉嫩化。盡管肌肉中的內(nèi)源酶包括組織蛋白酶、蛋白酶體和鈣激活酶三種酶,但研究表明鈣激活酶對肉類的嫩化是至關(guān)重要的[11,24]。

高橋[23]認(rèn)為,動物死亡后,肌漿中的Ca2+濃度增大2000倍,此時由Ca2+直接作用導(dǎo)致肌原纖維和中間纖維的非酶促脆弱化而使肌肉弱化,從而提出了肉類嫩化的“非酶鈣理論”。但是,許多研究都證實了酶的作用[12-15]。Pohlman等人[22]也確認(rèn):超聲波作用于肉類可以促進(jìn)增加Ca2+對鈣激活酶的有效性。Geesink等人[25]則指出,Ca2+濃度與肌原纖維小片化指數(shù)(myofibrillar fragmentation index,MFI)顯著相關(guān),而肌肉的嫩化與肌鈣蛋白-T的降解顯著相關(guān)。由于肌鈣蛋白-T是鈣激活酶的底物,因此,其降解過程不是通過Ca2+的直接作用,而是鈣激活酶作用的結(jié)果。本實驗用超聲波處理得出的結(jié)果也表明肌肉的嫩化與鈣激活酶呈負(fù)相關(guān)(R2>0.76),支持了肉類嫩化的酶促機(jī)理。

4 結(jié)論

超聲波處理可以激活鴨肉中鈣激活酶活性從而降低肌肉的剪切力。最適的超聲波處理條件為 300W功率、15min處理時間。

利用不同功率的超聲波及不同超聲波處理時間嫩化鴨肉的結(jié)果都顯示出鈣激活酶與肌肉剪切力之間呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)(R2>0.76)。

超聲波處理能夠激活鴨肉中的鈣激活酶,對鴨肉的嫩化具有促進(jìn)機(jī)理。

[1]阿部申,平田明弘,木村貞司,等. 廃鶏肉の硬さに及ぼすコラーゲンの影響[J]. 日本食品科學(xué)工學(xué)會誌,1996,43:831-834.

[2]Northcutt J K,Buhr R J,Young L L,etal. Influence of age and postchill carcass aging duration on chicken breast fillet quality[J]. Poultry Science,2001,80:808-812.

[3]徐幸蓮,周光宏,劉海斌.淘汰蛋雞與普通肉雞肌肉品質(zhì)的比較研究[J].食品工業(yè)科技,2001,22(6):28-30.

[4]Chemat F,Zill-e-Huma,Khan M K. Applications of ultrasound in food technology:processing,preservation and extraction[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2011,18:813-835.

[5]Got F,Culioli J,Berge P,etal. Lethiecq M,Effects of high-intensity high-frequency ultrasound on ageing rate,ultrastructure and some physic-chemical properties of beef[J]. Meat Science,1999,51:35-42.

[6]Pohlman F W,Dikeman M E,Kropf D H. Effects of high intensity ultrasound treatment,storage time and cooking method on shear,sensory,instrumental color and cooking properties of packaged and unpackaged beef pectoralis muscle[J]. Meat Science,1997,46:89-100.

[7]Dickens J A,Lyon C E,Wilson R L. Effect of ultrasonic radiation on some physical characteristics of broiler breast muscle and cooked meat[J]. Poultry Science,1991,70:389-396.

[8]Vimini R J,Kemp J D,Fox J D. Effects of low frequency ultrasound on properties of restructured beef rolls[J]. Journal of Food Science,1983,48:1572-1573.

[9]Reynolds J B,Anderson D B,Schmidt G R. Effects of ultrasonic treatment on binding strength in cured ham rolls[J]. Journal of Food Science,1978,43:866-869.

[10]Stadnik J,Dolatowski S Z,Baranowska H M. Effect of ultrasound treatment on water holding properties and microstructure of beef(m. semimembranosus)during ageing[J]. LWT-Food Science and Technology,2008,41:2151-2158.

[11]Lee H L,Santé-Lhoutellier V,Vigouroux S,etal. Role of Calpains in Postmortem Proteolysis in Chicken Muscle[J]. Poultry Science,2008,87:2126-2132.

[12]Koohmaraie M. The role of Ca2+-dependent proteases(calpains)in postmortem proteolysis and meat tenderness[J]. Biochimie,1992,74:239-245.

[13]Huff-Lonergan E,Mitsuhashi T,Beekman D D,etal. Proteolysis of specific muscle structural proteins by μ-calpain at low pH and temperature is similar to degradation in postmortem bovine muscle[J]. Journal of Animal Science,1996,74:993-1008.

[14]Geesink G H,Koohmaraie M. Effect of calpastatin on degradation of myofibrillar proteins by μ-calpain under postmortem conditions[J]. Journal of Animal Science,1999,77:2685-2692.

[15]Koohmaraie M,Geesink G H. Contribution of postmortem muscle biochemistry to the delivery of consistent meat quality with particular focus on the calpain system[J]. Meat Science,2006,74:34-43.

[16]Koohmaraie M. Quantification of Ca2+-dependent protease activities by hydrophobic and ion-exchange chromatography[J]. Journal of Animal Science,1990,68:659-665.

[17]李正英,陳錦屏,陳忠軍,等. 羊肉超聲波嫩化技術(shù)的研究[J]. 食品科學(xué),2006,27(12):413-416.

[18]Jayasooriya S D,Torley P J,D’Arcy B R. Bhandani B R,Effects of high power ultrasound and ageing on the physical properties of bovine Semitendinosus and Longissimus muscles[J].Meat Science,2007,75:628-639.

[19]Smith N B,Cannon J E,Novakofski J E,etal. Tenderization of Semitendinosus muscle using high intensity ultrasound[J]. In Proceedings of the IEEE ultrasonics symposium,p.1371-1374,Orlando,FL,USA,1991.

[20]Lee S,Stevenson-Barry J M,Kauffman R G,etal. Effect of ion fluid injection on beef tenderness in association with calpain activity[J]. Meat Science,2000,56:301-310.

[21]Koohmaraie M,Babiker A S,Merkel R A,etal. Role of Ca2+-dependent proteases and lysosomal enyzmes in postmortem changes in bovine skeletal muscle[J]. Journal of Food Science,1988,53:1253-1257.

[22]Pohlman F W,Dikeman M E,Zayas J F. The effects of low-intensity ultrasound treatment oh shear properties,color stability and shelf-life of vacuum-packaged beef semitendinosus and biceps femoris muscle[J]. Meat Science,1997,45:329-337.

[23]高橋興威. 熟成に伴う食肉軟化の分子機(jī)構(gòu)[J]. 日本食品科學(xué)工學(xué)會誌,1997,44:543-551.

[24]Ouali A. Meat tenderization:possible causes and mechanisms. A Review[J]. Journal of Muscle Foods,1990,1:129-165.

[25]Geesink G H,Taylor R G,Bekhit A E D,etal. Evidence against the non-enzymatic calcium theory of tenderization[J]. Meat Science,2001,59:417-422.

Study on effect of ultrasound treatment on calpain activityof spent laying duck muscles

QIN Wei-dong,MA Li-hua,CHEN Xue-hong,WANG Jia-jun

(Food Engineering School of Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221000,China)

The effect of ultrasound tenderization of spent laying duck pectoralis muscle were studied in different powers and ultrasound treatment times. The results indicated that activity of calpain in the pectoralis muscle was increased by the ultrasound treatment and proteolysis of myofibrillar by calpain reduced the shear force of the muscle. Two important factors were the ultrasound power and ultrasound treatment time in determination of the tendered effect. The optimum conditions for ultrasound tenderization of spent laying duck pectoralis muscle were 300W of power and 15min of the treatment time,respectively. The results of correlation analysis demonstrated that there were negative correlation(R2>0.76)between activity of calpain and the shear force of the muscle.

spent laying duck;ultrasound;tenderization;calpain

2014-05-04

秦衛(wèi)東(1961-)，男，本科，教授，研究方向：畜禽科學(xué)與加工。

國家富民強(qiáng)縣項目(BN2011209)。

TS253.1

A

1002-0306(2015)03-0078-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.007