甲潑尼松龍治療大鼠脊髓損傷的行為學(xué)和組織病理學(xué)研究

董樂樂 郭鵬年 于澤

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨二科，包頭014010

甲潑尼松龍治療大鼠脊髓損傷的行為學(xué)和組織病理學(xué)研究

董樂樂 郭鵬年 于澤

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨二科，包頭014010

目的探討脊髓損傷后應(yīng)用甲潑尼松龍對(duì)大鼠行為學(xué)及組織病理學(xué)的作用。方法將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成A、B、C三組，A組為正常對(duì)照組，B組為損傷對(duì)照組，C組為實(shí)驗(yàn)組，每組20只。A組采用單純?nèi)蛋迩谐?，不損傷脊髓；B、C組采用Allen法制作T10脊髓損傷模型。C組首計(jì)量以30mg/kg甲潑尼松龍尾靜脈注射，余計(jì)量以5.4mg/（kg·h）靜脈給藥，共23 h；A、B組以生理鹽水代替甲潑尼松龍尾靜脈注射，劑量同C組。術(shù)后1 d、1周、2周、4周對(duì)三組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能行為進(jìn)行BBB評(píng)分及斜板試驗(yàn)；再在術(shù)后1 d和4周各取10只大鼠受損節(jié)段脊髓行HE染色及光鏡下觀察。結(jié)果C組大鼠在損傷后各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)角度顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。組織病理學(xué)顯示脊髓損傷后大鼠脊髓組織出血、水腫，空洞形成，神經(jīng)組織溶解消失，明顯脫髓鞘改變。C組病理改變較B組輕。結(jié)論甲潑尼松龍可以抑制脊髓損傷后炎癥反應(yīng)，減少組織壞死及空洞范圍，改善大鼠運(yùn)動(dòng)行為功能。

甲潑尼松龍；脊髓損傷；行為學(xué)；組織病理學(xué)

隨著經(jīng)濟(jì)水平和工業(yè)化進(jìn)程發(fā)展，脊柱脊髓損傷發(fā)生率呈逐年升高趨勢，其往往導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體的嚴(yán)重功能障礙?；颊呒凹彝砩硇膫Φ耐瑫r(shí)也給社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。各國學(xué)者歷年來在脊髓損傷的預(yù)防、治療和康復(fù)方面做了大量研究，目前仍沒有行之有效的方法。美國脊髓損傷學(xué)會(huì)提出早期大劑量應(yīng)用甲潑尼松龍可以顯著控制急性脊髓損傷的炎癥反應(yīng)，減輕繼發(fā)性損傷，是臨床上治療急性脊髓損傷的首選藥物[1]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用甲潑尼松龍沖擊療法（NASCISⅡ方案[2]）治療大鼠脊髓損傷，研究大鼠損傷脊髓組織形態(tài)學(xué)變化和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況，為藥物臨床應(yīng)用提供新的可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

60只SD大鼠，雄性，體重380～420 g（購于北京維通利華公司）。注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（購自Pfizer Manufacturing Belgium NV公司）。自制改良Allen法脊髓打擊器。

1.2 動(dòng)物分組和模型制作

將60只大鼠隨機(jī)分為三組。A組：正常對(duì)照組；B組：損傷對(duì)照組；C組：實(shí)驗(yàn)組，每組20只。參照Allen重量垂直打擊法制作大鼠急性脊髓損傷模型。10%水合氯醛（0.3ml/100 g）腹腔麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪去背毛，以T10棘突為中心取背部后正中切口，將T9～T11椎板輕柔切除，用改良Allen法脊髓打擊器以5 cm×10 g的能量垂直打擊B組和C組大鼠脊髓。當(dāng)大鼠尾巴呈痙攣性擺動(dòng)，雙下肢及軀體回縮撲動(dòng)，雙下肢癱瘓表明為撞擊成功。A組實(shí)驗(yàn)過程同B、C組一致，切除T9～T11椎板，顯露相應(yīng)階段脊髓，但不做脊髓撞擊。C組大鼠在完成脊髓打擊后，立即給予甲潑尼松龍注射沖擊治療，首劑以30mg/kg尾靜脈注射甲潑尼松龍，1 h后按5.4mg/（kg·h）靜脈給藥，共23 h；A、B組在同時(shí)間點(diǎn)靜脈注射等體積生理鹽水。所有動(dòng)物在安靜、通風(fēng)環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22～24℃，自由飲食，每日定時(shí)膀胱區(qū)按壓排尿4次。

1.3 行為學(xué)評(píng)分

在術(shù)前及術(shù)后1 d、1周、2周、4周對(duì)每組大鼠行BBB評(píng)分[3]和改良Rivlin-Tator斜板試驗(yàn)[4]。評(píng)分由三位非本實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行盲法評(píng)分，取平均值。

BBB評(píng)分法：Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC法，將大鼠放置于2m的圓形平臺(tái)上，觀察其肢態(tài)、行走、活動(dòng)和肢體協(xié)調(diào)情況，詳細(xì)記錄數(shù)據(jù)。

改良Rivlin-Tator斜板試驗(yàn)操作方法是：將大鼠放置在有1mm厚度紋理的橡皮斜板上，大鼠身體長軸與斜板縱軸呈垂直位放置，斜板每次升高5°，以大鼠能夠停留5 s的最大角度為其功能值。

1.4 脊髓組織取材及病理學(xué)觀察

傷后1 d、4周每組取10只大鼠，先行行為學(xué)評(píng)分后再麻醉，立即取出損傷段脊髓2 cm，標(biāo)記損傷頭尾端，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋并切片，片厚5μm，HE染色，在光鏡下觀察各組大鼠脊髓組織的病理變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脊髓神經(jīng)功能的比較

2.1.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分的比較術(shù)前三組大鼠的BBB評(píng)分均接近正常值21分，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后各組內(nèi)BBB評(píng)分隨著脊髓功能的恢復(fù)呈增高趨勢，B、C組BBB評(píng)分均明顯低于A組，C組BBB評(píng)分明顯高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分的比較（分，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分的比較（分，±s）

與A組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.01；與B組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.01

組別1 d 1周2周4周A組B組C組19.60±0.97 0.80±0.63*2.40±1.07*#20.05±0.75 2.31±0.52*3.86±0.63*#20.12±0.80 3.14±0.56*6.13±1.17*#20.41±0.87 5.35±1.07*10.87±0.86*#

2.1.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)斜板試驗(yàn)角度的比較術(shù)前各組大鼠斜板試驗(yàn)均在65°左右，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脊髓損傷1周后，B、C組的臨界角度開始上升，隨著時(shí)間延長，斜板試驗(yàn)角度逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表2）。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)斜板試驗(yàn)角度的比較（°，±s）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)斜板試驗(yàn)角度的比較（°，±s）

與A組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.01；與B組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.01

組別1 d 1周2周4周A組B組C組65.1±2.3 29.1±1.8*33.9±2.6*#64.4±1.8 34.2±1.4*39.2±2.5*#63.8±1.65 34.9±2.10*46.5±2.82*#66.5±2.95 37.6±1.91*55.4±2.54*#

2.2 各組大鼠組織病理學(xué)改變

HE染色特點(diǎn)：A組各時(shí)間點(diǎn)見脊髓形態(tài)完好，灰質(zhì)內(nèi)可見神經(jīng)元胞體，神經(jīng)元及神經(jīng)軸突結(jié)構(gòu)正常；B組在損傷后脊髓組織水腫、出血，灰白質(zhì)多灶性出血，神經(jīng)元腫脹、輪廓不清，部分髓鞘破裂溶解，軸突腫脹，膠質(zhì)增生；C組脊髓組織結(jié)構(gòu)尚完整，水腫出血較B組輕，膠質(zhì)纖維增加（圖1、圖2）。

圖1 1 d后脊髓組織HE染色結(jié)果（×400）

圖2 4周后脊髓組織HE染色結(jié)果（×400）

3 討論

脊髓的各種損傷都會(huì)造成脊髓中神經(jīng)元的變性壞死，由于局部微環(huán)境的改變[4-7]不再適合神經(jīng)元的再生和修復(fù)，多導(dǎo)致截癱等嚴(yán)重并發(fā)癥，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。脊髓損傷后神經(jīng)功能的喪失主要由原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷引起[8]。原發(fā)性損傷是指機(jī)械損傷直接造成的脊髓結(jié)構(gòu)破壞，隨后的繼發(fā)性損傷導(dǎo)致脊髓神經(jīng)功能的進(jìn)一步惡化。甲潑尼松龍為人工合成的糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗水腫和抗氧化等典型的糖皮質(zhì)激素作用[9-10]。早期大劑量應(yīng)用甲潑尼松龍治療可以有效抑制第二相損傷反應(yīng)[11-12]。1990年Bracken等[13]報(bào)告的NASCISⅡ研究結(jié)果顯示，急性脊髓損傷后8 h以內(nèi)用大劑量甲潑尼松龍治療組與安慰劑組相比，在神經(jīng)功能的改善方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。1997年Bracken等[14]報(bào)告了NASCISⅢ的研究結(jié)果，在脊髓損傷后3～8 h接受甲潑尼松龍沖擊治療的大鼠，在運(yùn)動(dòng)功能改善方面，甲潑尼松龍24 h治療組遠(yuǎn)不如48 h治療組。但Huribert[15]提出不同的意見，認(rèn)為臨床中應(yīng)考慮采用24 h甲潑尼松龍沖擊治療，而不建議使用48 h。本實(shí)驗(yàn)早期大劑量應(yīng)用甲潑尼松龍治療大鼠急性脊髓損傷，探討甲潑尼松龍對(duì)大鼠損傷脊髓的組織病理學(xué)改變和神經(jīng)功能的影響。

脊髓損傷后的病理改變?cè)趥? d已有明顯表現(xiàn)，繼發(fā)反應(yīng)嚴(yán)重，應(yīng)用甲潑尼松龍組壞死輕，炎癥反應(yīng)減弱。傷后4周光鏡下可見脊髓灰質(zhì)及周邊白質(zhì)壞死組織降解液化，空洞形成，周圍環(huán)繞致密的膠質(zhì)瘢痕，明顯脫髓鞘改變。甲潑尼松龍組空洞明顯縮小，說明甲潑尼松龍可抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)未損傷的少突膠質(zhì)細(xì)胞，組織壞死減少，空洞范圍減小，有利于軸突的再生[16-18]。

在行為學(xué)上，各組BBB評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)角度增長趨勢一致，與潘峰等[19]的研究結(jié)果相同。甲潑尼松龍實(shí)驗(yàn)組在2～4周BBB評(píng)分上升較快，此時(shí)大鼠可以行走及支撐自體體重，前后肢的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)也有恢復(fù)，但精細(xì)運(yùn)動(dòng)的恢復(fù)相對(duì)來說是一個(gè)長期、緩慢的過程。斜板試驗(yàn)角度在甲潑尼松龍實(shí)驗(yàn)組2周前上升較緩和，之后升高幅度增大，提示體位控制能力在后期恢復(fù)可能要好于前期，可以認(rèn)為甲潑尼松龍?jiān)缙谥委熆梢砸种蒲装Y反應(yīng)[20]，減少組織壞死及空洞范圍，有利于提高行為學(xué)評(píng)分。

本實(shí)驗(yàn)提示脊髓損傷后早期大量應(yīng)用甲潑尼松龍治療可減輕炎癥反應(yīng)，在動(dòng)物行為學(xué)及組織病理學(xué)上有明顯改善，甲潑尼松龍促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的作用機(jī)制將在下一步研究中探討。

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Research on behavioristics and histopathology of methylprednisolone in the treatment of ratw ith spinal cord injury

DONG Le-le GUO Peng-nian YU Ze
Two Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Baotou 014010,China

Objective To study effect on behavioristics and histopathology ofmethylprednisolone in the treatment of rat with spinal cord injury.M ethods Sixty SD male ratswere randomly divided into three groups,each group had 20 rats. Group A was normal control group,group B was injury control group,and group C was treatment group.Rats′spine in group A wasmerely respected by total laminectomy without any hurts to its spinal cord.Both group B and C were assigned to be evaluated by using spinal cord injury model(T10)made by Allen method.Rats in group C were injected methylprednisolone which amounted to 30 mg/kg at the beginning.However,the remaining were injected at the amount of 5.4 mg/kg each time,23 hours to the end.Methylprednisolone was replaced by normal saline instead in group A and B,the same dose of group C.After operation of 1 day,1 week,2 weeks and 4 weeks,the hind limbmotor function including BBB score and inclined plane test among three groups were applied.After operation of 1 day and 4 weeks,injured spinal cord of 10 rats were observed undermicroscopy after HE-staining.Results BBB score and inclined plane test angle in group C was significantly higher than that in group B at each time point respectively,with statistical difference (P<0.01).Histopathological study showed that hemorrhage and edema in the spinal cord after injury,and vacuolation in cells,nervous tissuemelted and demyelination changed.Pathological changed of group C was lighter than that in group B.Conclusion Methylprednisolone can restrain inflammatory response of spinal cord injury,reduce range of cavity and tissue necrotic,improve function of behavior.

Methylprednisolone;Spinal cord injury;Behavioristics;Histopathology

R683.2

A

1674-4721（2015）04（c）-0026-04

2015-03-13本文編輯：李亞聰）

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2009MS1116）