凹葉厚樸葉總黃酮純化工藝研究*

易 駿 ，吳巖斌 ，吳錦玉，王 濤

（1.福建教育學(xué)院，福州 350025；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

厚樸為木蘭科多年生落葉喬木，主要分布在長江以南，多有栽培，資源豐富。一般需要12 a樹齡以后的厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.）或凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.），其入藥部位干燥干皮、根皮及枝皮活性成分穩(wěn)定[1]，期間，每年秋季厚樸葉自然凋落腐爛。厚樸葉為大型葉，長20～45 cm，寬10～25 cm，生物量較大，引起人們對厚樸葉資源利用價值研究的興趣。近年來研究表明，厚樸葉主要含有木脂素類、黃酮類、生物堿類和揮發(fā)油等成分[2-6]，具有抗菌、鎮(zhèn)咳、抗氧化和血管舒張等作用[7-10]，其中總黃酮含量約為5.01%[11]。因此，有必要研究其總黃酮的純化工藝，為進(jìn)一步開發(fā)利用凹葉厚樸葉總黃酮資源提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 凹葉厚樸葉采自福建省南平市光澤縣境內(nèi)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓副教授鑒定為凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.）的干燥葉。D101、AB-8、HPD-100、HPD-722、HPD-400、HPD-400A、DM130、DM301型大孔吸附樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司。槲皮苷對照品（自制），ABTS試劑（美國Sigma公司），DPPH（日本和光純藥株式會社），BHT（海華藍(lán)生物科技有限公司，批號26973），甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 UV-1800紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司），SHB-Ш循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司），RZ01C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司），HH-S恒溫水浴鍋（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司），KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），AR2130千分之一天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]，CP225D十萬分之一天平（德國賽多利斯），ELIX5純水制備系統(tǒng)（廈門精藝興業(yè)科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 凹葉厚樸葉粗粉經(jīng)乙醇濃度為75%回流提取3次，過濾，合并濾液，回收小體積，3 600 r/min的速度離心10 min，得凹葉厚樸葉樣品液，濃度為0.12 g/mL，備用。

2.2 大孔樹脂的預(yù)處理 根據(jù)購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司的樹脂預(yù)處理方法：在樹脂柱內(nèi)加入高于樹脂層10 cm的乙醇浸泡4 h，放出浸液，至洗滌液在試管中加水稀釋不渾濁并且洗脫液用紫外光譜掃描不得檢出吸收峰為止。再用水洗滌至乙醇含量小于1%，即可使用。

2.3 大孔樹脂的靜態(tài)吸附

2.3.1 最佳大孔樹脂考察 于100 mL三角瓶中裝入已處理好的干樹脂各1 g，加入凹葉厚樸葉樣品液20 mL，置于搖床中振蕩24 h，測定濾液中總黃酮的濃度。過濾上述樹脂，加入100 mL 95%乙醇，置于搖床中振蕩24 h，測定濾液中總黃酮的濃度。通過計(jì)算樹脂的吸附率和解吸附率確定最佳樹脂。由表1可知，弱極性的HPD722、非極性的HPD100、極性的HPD600、中極性的HPD400A和非極性的HP20對凹葉厚樸葉總黃酮吸附能力較強(qiáng)；而弱極性的DM130、弱極性的HPD722、中極性的HPD400、中極性的DM301和中極性的HPD400A解吸性能效果較好。綜合比較，選用效果較好的HPD722和HPD400A兩種樹脂進(jìn)行靜態(tài)動力吸附過程研究，以篩選出最佳的大孔樹脂。見表1。

表1 不同型號大孔樹脂的吸附率及解吸附率（s）

表1 不同型號大孔樹脂的吸附率及解吸附率（s）

解吸附率（%）94.75±6.23 91.29±4.32 86.03±7.28 94.07±5.98非極性 88.58±6.45 HPD100 非極性 88.99±4.58 90.73±7.51 HPD400A 中極性 86.19±6.58 93.52±6.12 HP20 非極性 87.10±6.23 89.71±3.75 DM301 中極性 82.67±3.24 93.33±5.68 AB-8 弱極性 83.71±4.32 89.44±7.58

2.3.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附考察 于100 mL三角瓶中裝入已處理好的干樹脂各1 g，加入凹葉厚樸葉樣品液20 mL，置于搖床中振蕩，每隔1 h測定厚樸葉中總黃酮濃度，然后計(jì)算吸附率，得到靜態(tài)等溫吸附曲線。見圖1。

圖1 兩種樹脂的靜態(tài)等溫吸附曲線

綜合以上因素考慮，HPD722大孔樹脂具有較高的吸附率和解吸附率，故選HPD722大孔樹脂純化凹葉厚樸葉總黃酮工藝。

2.4 大孔樹脂的動態(tài)吸附

2.4.1 上樣濃度考察 取已處理好的6份干樹脂,每份7 g，分別濕法裝柱（20 mm×28 cm，填裝柱體積為36 mL，柱高18 cm），加凹葉厚樸葉總黃酮樣品液 稀 釋 為 含 生 藥 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14 g/mL的溶液各20 mL上樣，以1 BV/h的流速進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附完成后，用蒸餾水洗脫至洗脫液無色，再用100 mL 95%乙醇洗脫，測定總黃酮回收率，選擇最佳上樣濃度。結(jié)果如圖2所示，隨著上樣液濃度的增加，總黃酮回收率明顯增加，且達(dá)到一定濃度，總黃酮回收率增加不明顯，當(dāng)上樣液濃度為0.1 g/mL時，總黃酮回收率最高?？紤]到，上樣量小，不利于大規(guī)模生產(chǎn)，且上樣液濃度為0.12 g/mL的總黃酮回收率與0.1 g/mL相當(dāng)，綜合考慮，應(yīng)選取0.12 g/mL為最佳上樣濃度。見圖2。

圖2 上樣濃度對回收率的影響

2.4.2 上樣流速考察 取已處理好的4份干樹脂,每份7 g，分別濕法裝柱，加凹葉厚樸葉總黃酮樣品液含生藥 0.12 g/mL，各 20 mL，分別以 1、2、3、4 BV/h流速進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附完成后，用蒸餾水洗脫至洗脫液無色，再用100 mL 95%乙醇洗脫，測定總黃酮回收率，選擇最佳上樣流速。結(jié)果如圖3所示，隨著上樣流速的增加，總黃酮回收率明顯下降；考慮到大規(guī)模生產(chǎn)，且上樣流速為1 BV/h的總黃酮回收率與2 BV/h相當(dāng)，綜合考慮，應(yīng)選取2 BV/h為最佳上樣流速。

圖3 上樣流速對回收率的影響

2.4.3 大孔樹脂動態(tài)吸附曲線考察 取已處理好的干樹脂7 g，濕法裝柱，加凹葉厚樸葉總黃酮樣品液含生藥0.12 g/mL 20 mL，以2 BV/h的流速進(jìn)行動態(tài)吸附，每0.5 BV收集1個流份，測定總黃酮的濃度，得到動態(tài)吸附曲線。結(jié)果如圖4所示，隨著總黃酮上樣量的增加，流出液中總黃酮的量也隨之增加；當(dāng)上樣量為1 BV時有少量總黃酮流出，上樣量達(dá)到5.5 BV時出現(xiàn)明顯泄漏點(diǎn)（泄漏點(diǎn)為初始濃度的1/10），由此確定凹葉厚樸葉總黃酮上樣液的最大體積為5.5 BV。

圖4 HPD722動態(tài)吸附曲線

2.4.4 洗脫溶劑考察 取已處理好的干樹脂7 g,濕法裝柱，加凹葉厚樸葉總黃酮樣品液含生藥0.12 g/mL，以2 BV/h的流速進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附完成后，用蒸餾水洗脫至洗脫液無色，合并洗脫液；再分別用10%、30%、50%、75%、95%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的回收率。結(jié)果如圖5所示，厚樸葉總黃酮主要集中在10%～50%，10%乙醇洗脫液較少總黃酮，且顏色深，表明含有許多的雜質(zhì)。因此，洗脫時，先用蒸餾水洗至無色后，用10%乙醇洗去雜質(zhì)，再用50%乙醇洗脫得到總黃酮。

圖5 洗脫溶劑對回收率的影響

2.4.5 洗脫劑用量考察 取已處理好的干樹脂7 g，濕法裝柱，加厚樸葉總黃酮樣品液含生藥0.12 g/mL，以2 BV/h的流速進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附完成后，用蒸餾水洗脫至洗脫液無色，再用50%乙醇洗脫，每0.5 BV收集1份，測定收集液總黃酮的濃度。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到4 BV時，厚樸葉總黃酮基本洗脫完全，所以洗脫劑用量為4 BV。

圖6 洗脫劑用量對回收率的影響

2.5 純化前后凹葉厚樸葉總黃酮純度的測定 取2.1項(xiàng)制備供試品溶液3份，濃度為0.12 g/mL，以2 BV/h上樣，上樣體積為5.5倍柱體積，用3.5倍柱體積10%乙醇除去雜質(zhì)，再用4倍柱體積50%乙醇洗脫，最終得到純化后的總黃酮，經(jīng)減壓濃縮，得到總黃酮浸膏，備用。測定純化前后總黃酮純度，結(jié)果見表2。

表2 純化前后凹葉厚樸總黃酮的純度（s）

表2 純化前后凹葉厚樸總黃酮的純度（s）

純化前后純化前純化后n 浸膏質(zhì)量（mg）浸膏中總黃酮質(zhì)量（mg）總黃酮純度（%）3 3 1 872.61±57.33 513.95±23.05 27.44±0.42 856.04± 6.99 529.74±10.35 61.88±0.74

2.6 純化前后凹葉厚樸葉總黃酮抗氧化活性評價

2.6.1 供試品制備 純化前后純度分別為27.44%和61.67%的總黃酮浸膏，備用。

2.6.2 抗氧化活性的測定 清除DPPH自由基分別取2mL不同濃度供試品的甲醇溶液（20~100 mg/L），加入0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液2 mL，避光反應(yīng)30 min，以2 mL不同濃度的BHT為陽性對照，空白對照用80%甲醇代替樣品溶液，80%甲醇調(diào)0，在517 nm波長處測吸光度。以樣品濃度和清除率計(jì)算IC50值。清除DPPH自由基的能力用半數(shù)抑制率IC50表示，IC50越小，清除自由基的能力越強(qiáng)。

式中：A0為空白對照的吸光度，A1為供試品的吸光度。

通過對純化前后總黃酮清除DPPH自由基測定，結(jié)果如表3、圖7，凹葉厚樸葉總黃酮具有清除DPPH自由基的活性，并在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均呈明顯量效關(guān)系。純化后總黃酮清除DPPH自由基活性較強(qiáng)，其 IC50為（19.97±0.85）mg/L，純化前總提物IC50為（44.88±1.31）mg/L?？梢娂兓罂傸S酮清除DPPH自由基活性大大提高。

表3 凹葉厚樸葉總黃酮對DPPH和ABTS自由基的清除作用（s）mg/L

表3 凹葉厚樸葉總黃酮對DPPH和ABTS自由基的清除作用（s）mg/L

自由基 純化前的IC50 純化后的IC50 BHT的IC50 DPPH 44.88± 1.31 19.97±0.85 11.13±0.10 ABTS 592.2±13.14 169.78±0.99 90.70±0.98

圖7 凹葉厚樸總黃酮純化前后對DPPH自由基的清除作用

清除ABTS自由基取7 mmol/L的ABTS與2.45 mmol/L過硫酸鉀等體積混合23℃暗處反應(yīng)12~16 h，得到ABTS+。用蒸餾水稀釋ABTS+溶液使其在734 nm下的吸光值在0.7±0.02之間。取ABTS+溶液（吸光度在0.7±0.02內(nèi)）3.9 mL加入0.1 mL 80%甲醇溶解的不同濃度的供試品溶液（100~900 mg/L），搖勻，23℃放置6 min，在734 nm波長處測吸光度。用80%甲醇代替樣品作為空白對照。清除ABTS自由基的能力用半數(shù)抑制率IC50表示，IC50越小，清除自由基的能力越強(qiáng)。

式中：A0為空白吸光值；A1為樣品吸光值。

通過對純化后總黃酮清除ABTS自由基測定，結(jié)果如表3、圖8，凹葉厚樸葉總黃酮具有清除ABTS自由基的活性，并在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈明顯量效關(guān)系。純化后總黃酮清除ABTS自由基活性較強(qiáng)，其 IC50為（169.78±0.99）mg/L、純化前總提取物IC50為（592.2±13.14）mg/L?？梢娂兓罂傸S酮清除ABTS自由基活性大大提高。

圖8 凹葉厚樸葉總黃酮純化前后對ABTS自由基的清除作用

3 討論

目前分離純化總黃酮方法主要有柱層析法、大孔樹脂吸附法、高速及高效逆流色譜、薄層層析、雙水相萃取法等方法[12]，其中大孔樹脂吸附法具有快速、高效、方便、靈敏、選擇性好等，而且再生處理比較方便，成本較低，因此被廣泛用于分離純化中藥活性成分，但不同型號的大孔樹脂，其純化活性成分的條件差異較大[13]，因此，在應(yīng)用大孔樹脂進(jìn)行分離純化時要對樹脂的型號進(jìn)行選擇[14]。不同型號大孔樹脂主要是由于大孔樹脂比表面積、表面電性、能否與化合物形成氫鍵吸附等[13]，因此需要考察大孔樹脂對被純化產(chǎn)生動態(tài)吸附和靜態(tài)吸附的影響，進(jìn)而提高對中藥活性成分的純化率[15]。在實(shí)驗(yàn)室考察指標(biāo)設(shè)置上充分考慮工業(yè)化生產(chǎn)的需求，同時要注意大孔樹脂重復(fù)使用對工業(yè)生產(chǎn)中降低生產(chǎn)成本、節(jié)約工時和提高生產(chǎn)效率的意義[16]。按照吸附率、解吸附率方法確定最佳型號大孔樹脂為HPD722大孔樹脂，其對凹葉厚樸葉總黃酮具有較好的純化作用，凹葉厚樸葉總提物經(jīng)HPD722大孔樹脂純化后總黃酮純度由原來的27.44%提高到61.67%，而且抗氧化活性得到提高，主要是基于黃酮類化合物因具有酚羥基等結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)良好的抗氧化活性[17-18]。

自由基與許多疾病的產(chǎn)生有關(guān)，如腫瘤、心腦血管疾病、白內(nèi)障、慢性炎癥等疾病[19]。近年來，很多來自自然植物中的提取物已經(jīng)被證明具有較好的抗氧化活性[1]，其中黃酮類化合物在心血管系統(tǒng)作用和抗肝臟毒作用等方面有著廣泛的生理活性[20]。凹葉厚樸葉含有較高的黃酮，并可獲得純度達(dá)到61.67%的黃酮純度，因此有必要深入開展凹葉厚樸葉高純度黃酮的生理活性研究。

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