兔抗傷寒桿菌免疫血清在免疫學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用*

張淑莉,李 妮,張 琪(.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系檢驗(yàn)中心，西安 700；.陜西省核工業(yè) 47醫(yī)院,西安 70600)

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·論 著·

兔抗傷寒桿菌免疫血清在免疫學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用*

張淑莉1,李 妮1,張 琪2(1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系檢驗(yàn)中心，西安 710021；2.陜西省核工業(yè) 417醫(yī)院,西安 710600)

目的 探討制備高效價兔抗傷寒桿菌免疫血清的方法。方法 對家兔分組，采用短程免疫法，用傷寒桿菌“O”和“H”診斷菌液作為抗原，分別小劑量連續(xù)多次接種后，收集兔免疫血清，利用玻片凝集實(shí)驗(yàn)、試管凝集實(shí)驗(yàn)和間接凝集實(shí)驗(yàn)，測定血清中抗體的效價。結(jié)果 家兔在全程免疫后產(chǎn)生了高效價抗體，效價分別達(dá)到了陽性，1∶1 280、1∶640。結(jié)論 用傷寒桿菌免疫家兔，制備的免疫血清在短時間內(nèi)可以獲得高效價的抗血清，適用于免疫學(xué)檢驗(yàn)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

傷寒桿菌； 免疫血清； 制備； 效價； 免疫學(xué)檢驗(yàn)； 教學(xué)

傷寒桿菌屬沙門菌屬，為革蘭陰性桿菌，呈兩端鈍圓的短桿菌，無芽胞和莢膜，體周布滿鞭毛，傷寒桿菌的“O”、“H”抗原常用于臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室分型鑒定的抗原，“O”抗原為細(xì)菌壁脂多糖，是性質(zhì)穩(wěn)定的菌體抗原，耐熱，“H”抗原屬鞭毛蛋白質(zhì)，對熱不穩(wěn)定，為鞭毛抗原，可經(jīng)甲醛固定，利用上述特征將制備好的“O”和“H”抗原，分別免疫健康家兔，家兔體內(nèi)可產(chǎn)生高效價的抗“O”和抗“H”血清。隨后將這些抗血清應(yīng)用于例如凝集反應(yīng)、肥達(dá)反應(yīng)等《臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。動物免疫血清是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也是作者在醫(yī)學(xué)教學(xué)中經(jīng)常要用到的試劑。但目前市場上購買到的傷寒抗血清價格昂貴，效價也不高，因此為了節(jié)約經(jīng)費(fèi)，使用方便，提高實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)質(zhì)量，多年來本實(shí)驗(yàn)室自制抗血清，以傷寒桿菌“O”和“H”作為顆粒性抗原，在短時間內(nèi)制備出了高效價的免疫血清，實(shí)驗(yàn)效果較為理想?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性家兔10只，體質(zhì)量2～3 kg，年齡8個月，無免疫接種史，做好標(biāo)志，分籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分成2組，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[1]。

1.1.2 主要試劑 生理鹽水，SRBC，傷寒沙門菌“O”、“H”診斷菌液，用甲醛滅活的傷寒沙門菌制成，由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，濃度為7.0×109/mL。

1.1.3 設(shè)備與器材 冰箱，離心機(jī)，恒溫水浴箱，大剪刀，止血鉗，眼科手術(shù)剪，滅菌三角燒瓶，動脈導(dǎo)管，載玻片，兔解剖臺，試管，吸管，接種環(huán)，2.5 mL無菌注射器，酒精燈，U型微量反應(yīng)板等。

1.2 免疫抗原的制備

1.2.1 傷寒沙門菌O(H)診斷菌液 實(shí)驗(yàn)時，以無菌生理鹽水作1∶10稀釋，使菌液濃度為7.0×108/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹2]。

1.2.2 2% SRBC懸液 取適量抗凝綿羊血置于離心管中，加入適量生理鹽水，每次2 000 r/min離心10 min，用吸管吸去上清液，再加入2～3倍體積的生理鹽水，用吸管反復(fù)吹打混勻，如此反復(fù)洗滌3次，除去血漿蛋白。最后1次棄上清后，取紅細(xì)胞壓積，用生理鹽水配成2×108/mL(2%)SRBC懸液，置4 ℃的冰箱備用。

1.2.3 致敏SRBC的制備 取2%SRBC懸液與等量1∶10傷寒沙門菌O(H)菌液混合，置37 ℃水浴2 h，其間應(yīng)該每隔15 min搖動1次，取出后離心，棄上清液，用生理鹽水洗滌3次，最后用生理鹽水配成2%的致敏SRBC懸液。

1.3 免疫途徑和程序[3-5]選擇2～3 kg健康家兔10只，耳靜脈抽血少許分離血清，檢測有無與傷寒桿菌相關(guān)的凝集素;將家兔分成2組，分別用傷寒桿菌“O”和“H”抗原進(jìn)行免疫注射，每組各5只進(jìn)行免疫，2組免疫注射程序相同，具體免疫程序見表1。

表1 傷寒桿菌“O”和“H”抗原免疫家兔程序

注：-表示無數(shù)據(jù)。

1.4 試血 在末次免疫后第5天試血，用無菌注射器在家兔耳緣靜脈采血1 mL,分離血清，37 ℃溫育1 h，3 000 r/min離心20 min，吸取上清液置于F管中，初步測定采用試管凝集實(shí)驗(yàn)測定抗血清效價大于1∶320時，即可收獲血清，若效價不理想，可再注射抗原，再試血，直至達(dá)到要求。

1.5 采集免疫血清[6]稱兔子體質(zhì)量，以3%濃度的戊巴比妥鈉溶液，按30 mg/kg進(jìn)行耳緣靜脈推注麻醉，應(yīng)一邊注射一邊注意觀察兔子的眼瞼反射、瞳孔和呼吸的變化，麻醉好后將家兔仰臥位，四肢固定于兔解剖臺上，使其頭部略低，以充分暴露頸部，剃毛并消毒皮膚。沿頸部中線用手術(shù)刀切開皮膚約10 cm，分離皮下結(jié)締組織，暴露出肌層，用刀柄輕輕分離，暴露頸總動脈，選擇血管中段，遠(yuǎn)心端用細(xì)線結(jié)扎，近心端用動脈夾夾住動脈，注意勿損傷血管，用眼科小剪刀在近心端動脈壁上剪一“v”形缺口，將事先用肝素浸泡的無菌動脈導(dǎo)管一端插入近心端動脈中并用絲線固定，動脈導(dǎo)管另一端放入滅菌三角燒瓶中，然后緩緩松開動脈夾，血液很快射入到滅菌三角燒瓶中，2.5 kg家兔可放血80～100 mL。將三角燒瓶中的血液置于37 ℃水浴箱中，并做好標(biāo)志，1 h后置于冰箱4 ℃ 過夜，待血塊自然收縮后分離血清，分裝凍存，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測兔免疫血清效價

1.6.1 玻片凝集實(shí)驗(yàn) 取潔凈玻片2張，用記號筆分為2個等分，在玻片的左上角分別標(biāo)明“1”和“2”。于上述兩玻片的左端用滅菌的接種環(huán)各加生理鹽水1～2環(huán)，同樣右端各加1∶20傷寒沙門菌免疫血清1～2環(huán)，將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌，冷卻后取少許傷寒桿菌菌液，先置于第1號玻片左端與生理鹽水混勻，再取同種細(xì)菌加至第1號玻片右端與傷寒桿菌免疫血清混勻，輕輕搖動玻片，1～2 min后觀察結(jié)果。同樣，取大腸桿菌菌液加于第2號玻片兩端。并與1號玻片比較觀察。

1.6.2 試管凝集實(shí)驗(yàn)測抗O(H)血清效價 取9支試管，依次編號并做好標(biāo)志。將待測抗血清進(jìn)行系列倍比稀釋后與一定濃度的免疫用細(xì)菌菌液混勻，設(shè)生理鹽水對照管，使抗原抗體充分反應(yīng)，肉眼觀察每個試管的凝聚程度，以凝集出現(xiàn)“++”的最高稀釋度為血清中抗體的凝集效價。見表2。

1.6.3 間接凝集實(shí)驗(yàn) 取U型微量反應(yīng)孔9個，依次編號，傷寒沙門菌的多糖抗原與2%的綿羊紅細(xì)胞混勻于37 ℃作用下即為致敏紅細(xì)胞，將待測血清用鹽水作連續(xù)倍比稀釋，同時設(shè)生理鹽水對照組，加入致敏SRBC懸液，充分混勻后置37 ℃水浴2 h觀察結(jié)果。見表3。

表2 試管凝集操作程序

注：搖勻后置37 ℃水浴2～4 h，或室溫過夜后觀察結(jié)果。-表示無數(shù)據(jù)。

表3 間接血凝實(shí)驗(yàn)操作程序

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 玻片凝集實(shí)驗(yàn)測定血清效價結(jié)果 在充足光源黑色背景上觀察，可見1號載玻片右端液面會出現(xiàn)肉眼可見大小不等的乳白色的凝集顆?；蚰瘔K,混合懸液由均勻渾濁變?yōu)槌吻逋该鳎瑸槟磻?yīng)陽性(+)，說明制備的免疫血清與傷寒菌液抗原發(fā)生特異性結(jié)合，第1號玻片的左端和第2號玻片的左、右端生理鹽水與菌液不發(fā)生凝集，反應(yīng)后混合懸液仍呈均勻渾濁，沒有出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為陰性(-)結(jié)果。

2.2 試管凝集測定血清效價結(jié)果 判斷凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同樣需要有良好的光源和黑色的背景，應(yīng)先觀察鹽水對照管，先不振搖，管底沉淀物呈圓形、邊緣整齊，輕輕搖動試管，細(xì)菌分散呈均勻混濁，說明對照管無凝集現(xiàn)象。然后再分別觀察各實(shí)驗(yàn)管的凝集情況，并與對照管相比較。根據(jù)底部凝集物和凝集顆粒的松軟度、大小、均勻度等性狀及上清液的混濁程度，凝集程度通常以“++++”“+++”“++”“+”符號記錄。傷寒沙門菌“O”抗原凝集物呈顆粒狀沉于管底，輕搖時不易散開，黏于管底，“H”抗原凝集物呈絮狀，疏松而大塊地沉于管底，輕搖易離散。本次制備的傷寒診斷抗血清試管凝集效價為1∶1 280。見表4。

2.3 間接凝集實(shí)驗(yàn)測定血清效價結(jié)果 先觀察生理鹽水對照孔，紅細(xì)胞集中沉積孔底，呈一小圓點(diǎn)，邊緣整齊，不發(fā)生凝集為陰性。然后自第1孔開始觀察孔內(nèi)液體的渾濁程度及孔底凝集塊的大小。若紅細(xì)胞凝集，則均勻分布于孔底周圍，可根據(jù)紅細(xì)胞凝集程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以出現(xiàn)“++”凝集的最高稀釋度為血清中抗體的凝集效價。本次制備的傷寒診斷抗血清間接凝集效價為1∶640。見表5。

表4 試管凝集測定血清效價結(jié)果

注：-表示無數(shù)據(jù)。

表5 間接凝集測定血清效價結(jié)果

注：-表示無數(shù)據(jù)。

3 討 論

3.1 本次免疫血清的制備是一連續(xù)性、綜合性、系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用傷寒桿菌“O”和“H”標(biāo)準(zhǔn)菌液直接作為抗原免疫家兔，方法操作簡單，避免了抗原制備的繁雜程序，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，本次制備的傷寒診斷免疫血清試管凝集效價為1∶1 280，間接凝集效價為1∶640，本次實(shí)驗(yàn)獲得的抗血清效價較高，整個實(shí)驗(yàn)方案從免疫原的制備，動物的飼養(yǎng)，免疫程序的制定與實(shí)施，動物的采血，一直到抗血清的鑒定、保存。在整個實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)者既學(xué)習(xí)了自制抗血清的方法，又使實(shí)驗(yàn)者在理論上可印證抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程,對抗原、抗體等抽象的概念得以直觀理解，從實(shí)驗(yàn)角度包括了動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)、抗原的制備、凝集反應(yīng)等重要的免疫學(xué)技術(shù)。同時還能充分調(diào)動學(xué)習(xí)者的積極性和主動性，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)者分析問題和解決問題的能力，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)者創(chuàng)新思維、動手能力及加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)者的團(tuán)隊協(xié)作能力[7-8]。

3.2 將適當(dāng)?shù)念w粒性抗原物質(zhì)(如細(xì)菌、紅細(xì)胞等)反復(fù)多次注射到動物體內(nèi)，使之產(chǎn)生免疫應(yīng)答，經(jīng)過一段時間動物血清中出現(xiàn)大量特異性抗體，這種含抗體的血清稱為抗血清(或免疫血清)。免疫血清是經(jīng)過抗原免疫動物的血清，含有特異性免疫球蛋白。它不僅在病原生物學(xué)、免疫學(xué)檢驗(yàn)方面應(yīng)用十分廣泛，而且是一種非常重要的生物制品，大量用于病原體診斷與感染性疾病的緊急預(yù)防和治療[9]。

3.3 通過本次實(shí)驗(yàn)的設(shè)計及實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果來看，在1個月內(nèi)制備的兔抗傷寒免疫血清，具有免疫時間短，整個實(shí)驗(yàn)過程操作簡單易行，效價高，成本低，并將收集的抗血清作為診斷試劑隨后應(yīng)用于凝集反應(yīng)、肥達(dá)反應(yīng)等免疫學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，實(shí)驗(yàn)效果明顯,達(dá)到了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的要求，是高校免疫學(xué)檢驗(yàn)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中制備免疫血清簡便、實(shí)用的方法。

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Application of rabbit anti-Salmonella typhi immune serum in experiment teaching of immunology test*

ZHANGShu-li1,LINi1,ZHANGQi2

(1.TestingCenter,DepartmentofMedicalTechnologyofXi′anMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710021,China;2.417HospitalofShaanxiProvincialNuclearIndustry,Xi′an,Shaanxi710600,China)

Objective To investigate the preparation method of high titer rabbit anti-Salmonella typhi immune serum.Methods The rabbits were grouped.Using short-range immunization,with the typhoid bacillus “O” and “H” diagnostic liquid as antigen,after small dose and multiple respective inoculations,the rabbit immune serum was collected.The serum antibody titer was detected by using the slide agglutination test,tube agglutination test and indirect agglutination.Results The high titer antibodies in rabbits were produced after immunization and the titers reached positive 1∶1 280 and 1∶640 respectively.Conclusion The rabbit immune serum prepared by immunizing rabbits with typhoid bacillus can obtain the high titer immune serum in a short period of time,which is suitable for the experiment teaching of undergraduate immunology test.

Salmonella typhi； immune serum； preparation； titer； immunology examination； teaching

西安醫(yī)學(xué)院質(zhì)量工程檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)示范中心(XYZL2010-18)。

張淑莉，女，本科，實(shí)驗(yàn)師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)教學(xué)方面的工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.006

A

1672-9455(2015)18-2661-03

2015-03-25

2015-04-21)