電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對兔心肌缺血再灌注CK及心肌細胞活性的影響

王超,張佳麗,劉昭,劉密,嚴潔,常小榮,郭禮娜,艾坤(湖南中醫(yī)藥大學(xué),長沙 410007)

電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對兔心肌缺血再灌注CK及心肌細胞活性的影響

王超,張佳麗,劉昭,劉密,嚴潔,常小榮,郭禮娜,艾坤(湖南中醫(yī)藥大學(xué),長沙 410007)

目的觀察電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷兔CK及心肌細胞活性的影響,為證實心包經(jīng)穴位與心之間的相對特異性聯(lián)系提供實驗依據(jù)。方法將40只新西蘭大耳白兔隨機分為A組、B組、C組、D組和E組,每組8只。A組為假手術(shù)組;B組為缺血再灌注模型組,于左冠狀動脈前降支阻斷冠脈30 min,再灌注60 min;C組、D組和E組在造模前7 d,每日分別取內(nèi)關(guān)、列缺及合谷給予電針刺激20 min。比較各組肌酸激酶(CK)及心肌formazan含量變化。結(jié)果B組、C組、D組和E組血清CK及心肌formazan含量與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.05)。C組、D組和E組血清CK含量與B組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。C組心肌formazan含量與B組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。D組和E組血清CK 及心肌formazan含量與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.05)。結(jié)論電針內(nèi)關(guān)穴能減輕心肌缺血再灌注對心肌細胞的損傷,從而對心臟產(chǎn)生保護作用。

針刺療法;電針;心肌再灌注損傷;肌酸激酶;心肌細胞活性;穴,內(nèi)關(guān);穴,列缺;穴,合谷;兔

缺血性心臟病是冠狀動脈血流減少而引起心肌缺血、缺氧,甚至壞死而導(dǎo)致心臟病,而改善心肌缺血的方法是恢復(fù)灌流,但近年來研究表明恢復(fù)灌流仍能造成心肌細胞進一步的損傷,即心肌缺血再灌注損傷,防治心肌缺血再灌注損傷已成為冠心病治療亟待解決的關(guān)鍵問題之一[1]。針灸作為一種安全而療效獨特的治療手段,正在被廣泛地應(yīng)用于臨床。大量研究表明,針灸有利于改善心肌缺血再灌注損傷[2-3]。本實驗主要通過觀察電針預(yù)處理不同經(jīng)穴對兔心肌缺血再灌注損傷血清CK和細胞活性物質(zhì)的影響,來證實心包經(jīng)穴位與心之間的相對特異性聯(lián)系,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級新西蘭大耳白兔40只,雌雄各半,體重為1.5～2.5 kg,飼養(yǎng)溫度為20℃～25℃,月齡為3～4個月,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。常規(guī)飼養(yǎng)7 d后,隨機分為A組、B組、C組、D組和E組,每組8只。

1.2 造模方法

參照萬麗麗等[4]方法,兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦(4 mL/kg)作全身麻醉。頸部去毛,行氣管切開術(shù),接動物人工呼吸機。沿胸骨正中線左側(cè)旁開1～2 cm處切開皮膚,暴露心臟,輕輕剪開心包膜,提起左心耳,在左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿一根零號醫(yī)用縫合線,并置1根硅膠管結(jié)扎血管,立即監(jiān)測心電圖,若結(jié)扎前心電圖異常,則退出實驗。缺血標(biāo)志以左心室前壁發(fā)紺及心電圖ST段抬高為準則。關(guān)閉胸腔,缺血30 min后開胸,松開硅膠管,恢復(fù)左前降支灌流60 min。在造模過程中,結(jié)扎冠狀動脈失敗或未發(fā)生灌注或中途死亡則視為造模失敗,共有12只動物退出實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 A組

常規(guī)飼養(yǎng)7 d,開胸,左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿線不結(jié)扎,90 min后摘取心臟。

1.3.2 B組

常規(guī)飼養(yǎng)7 d,開胸,左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿線,阻斷冠脈30 min,再灌注60 min,摘取心臟。

1.3.3 C組

在造模前7 d進行電針治療,取雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴。穴位定位參照《實驗針灸學(xué)》[5]家兔常用針灸穴位圖譜,并結(jié)合解剖學(xué)進行穴位定位。內(nèi)關(guān)定位為前壁下1/6折點處內(nèi)側(cè),橈、尺骨間隙中。采用0.25 mm×13 mm毫針直刺3 mm,行提插捻轉(zhuǎn)手法1 min后接蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的SDZ-Ⅱ型電子治療儀,穴位處接負極,正極接兔尾部,采用疏密波,強度以雙上肢輕微顫動為度,留針20 min。電針治療7 d后,開胸,左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿線,阻斷冠脈30 min,再灌注60 min,摘取心臟。

1.3.4 D組

取列缺穴,采用擬人比照法定位。其余操作方法同C組。

1.3.5 E組

取合谷穴,位于前肢第1、2掌骨之間,其余操作方法同C組。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 肌酸激酶(CK)含量檢測

各組在灌流60 min后均采用真空采血管取頸動脈6 mL,分別等量注入空試管及含10%EDTA-Na2和抑肽酶的試管中,離心分離血清和血漿,移液槍分別吸取上清0.5 mL至離心管內(nèi),-20℃冰箱凍存,用酶聯(lián)免疫法檢測血清CK含量。

1.4.2 心肌formazan含量檢測

將從灌流裝置上取下的心臟組織切成薄片(1～2 mm),在37℃水浴中用1.25 g/L的MTT孵育30 min。然后取出心肌片,吸干表面水分并稱其濕重,按40 mL/g標(biāo)準加入二甲基亞砜后勻漿,勻漿液離心(1000×g,10 min),取上清液1 mL在490 nm處測量其吸光度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進行處理,各監(jiān)測指標(biāo)統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD法。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CK含量比較

由表1可見,B組、C組、D組和E組血清CK含量與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。C組、D組和E組血清CK含量與B組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。D組和E組血清CK含量與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 各組血清CK含量比較 (±s,U/L)

表1 各組血清CK含量比較 (±s,U/L)

注:與A組比較1)P＜0.01;與B組比較2)P＜0.01;與C組比較3)P＜0.01

組別 n CK含量A組 8 259.20±8.61 B組 8 2454.10±17.201)C組 8 945.69±9.711)2)D組 8 1870.20±12.141)2)3)E組 8 1909.10±19.151)2)3)

2.2 各組心肌formazan含量比較

由表2可見,B組、C組、D組和E組心肌formazan含量與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。C組心肌formazan含量與B組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。D組和E組心肌formazan含量與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組心肌formazan含量比較 (±s)

表2 各組心肌formazan含量比較 (±s)

注:與A組比較1)P＜0.05;與B組比較2)P＜0.05;與C組比較3)P＜0.05

組別 n 490 nm吸光度A組 8 1.20±0.03 B組 8 0.86±0.031)C組 8 1.13±0.021)2)D組 8 0.89±0.021)3)E組 8 0.88±0.031)3)

3 討論

肌酸激酶通常存在于動物心臟、肌肉等組織的大量細胞漿和線粒體中。在臨床上,當(dāng)心肌梗死發(fā)作時,人血清中的肌酸激酶水平迅速提高,因此血清酶的升高可作為心肌受損的酶學(xué)標(biāo)志物。實驗研究表明[6],電針內(nèi)關(guān)穴能有效降低家兔急性心肌缺血模型心肌酶的作用,對再次發(fā)作的急性心肌缺血有良好的預(yù)防和保護作用。

針灸預(yù)處理對大鼠缺血再灌注心肌細胞具有保護作用,可通過刺激缺血再灌注大鼠產(chǎn)生更多抗凋亡物質(zhì)而減少其細胞凋亡,從而有效防治缺血性心臟病的發(fā)生[7]。亦有實驗證明針刺心俞預(yù)處理對凋亡相關(guān)蛋白有調(diào)整作用,從而實現(xiàn)對心肌細胞的保護[8]。實驗研究表明,電針心包經(jīng)的經(jīng)穴對心動過緩大鼠的心率與心功能的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于胃經(jīng)經(jīng)穴,表明不同經(jīng)脈的穴位對心臟功能的調(diào)節(jié)有相對特異性[9]。根據(jù)穴位相近原則,本實驗亦選取了列缺與合谷為對照。列缺為手太陰肺經(jīng)絡(luò)穴,與內(nèi)關(guān)同為八脈交會穴,通任脈?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)列缺在一定程度上能改善心肌缺血狀況。王欣等[10]實驗研究發(fā)現(xiàn),電針肺經(jīng)“太淵-列缺”經(jīng)脈段可以顯著促進心力環(huán)面積的恢復(fù)及提高交感神經(jīng)的興奮性,從而改善家兔的心功能,對抗急性心肌缺血狀態(tài)。合谷為手陽明大腸經(jīng)原穴,有理氣活血通絡(luò)作用,吳松等[11]實驗研究表明電針合谷穴可以有效防治心肌肥厚,且優(yōu)于內(nèi)關(guān)、神門穴,這種保護作用可能與抑制TNF-α等炎癥細胞因子的表達有關(guān)。內(nèi)關(guān)穴是手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴、八脈交會穴之一?！鹅`樞?邪客》:“心者,五臟六腑之大主也,精神之所舍也,其臟堅固,邪弗能容也……故諸邪之在于心者,皆在于心之包絡(luò)?！碑?dāng)邪氣侵犯時,首先由心包代受,從而減輕心臟受到損害。實驗研究表明電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以減少心肌梗死范圍,降低心肌酶水平,減輕心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷[12]。同時針灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以抑制死亡受體通路Fas/FasL蛋白的表達,從而抑制缺血再灌注后細胞凋亡的發(fā)生,由此對心肌細胞發(fā)揮延遲相的保護作用[13]。

本實驗研究結(jié)果表明,與B組相比,C組能顯著降低血清CK含量,增加心肌細胞活性,而D組和E組對血清CK含量影響較小,對心肌細胞活性的影響則無統(tǒng)計學(xué)意義,表明電針內(nèi)關(guān)預(yù)處理能有效改善心肌細胞受損狀態(tài),激活心肌細胞活性,而對心臟產(chǎn)生一種保護作用;C組與D組和E組比較,血清CK含量明顯下降,而心肌細胞活性物質(zhì)明顯升高,其結(jié)果表明,內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血再灌注損傷心肌保護作用明顯優(yōu)于手太陰肺經(jīng)絡(luò)穴列缺穴以及手陽明大腸經(jīng)原穴合谷,驗證了心包經(jīng)與心臟聯(lián)系的相對特異性。針灸預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷的保護機制仍需要進一步闡明。近來研究發(fā)現(xiàn),線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔的開放、細胞內(nèi)鈣離子濃度增加、活性氧分子、過量的一氧化氮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和非折疊蛋白反應(yīng)等均可促進心肌細胞的自噬。因此,有必要在本研究基礎(chǔ)上進一步探討針灸預(yù)處理對MIRI過程中自噬的調(diào)控機制。

[1] 向道康,孫宗全,劉小斌,等.左-卡尼汀預(yù)處理對缺血再灌注大鼠心肌細胞的保護作用[J].貴州醫(yī)藥,2007,31(3):215-217.

[2] 張江玲,陳杰,王瑞祥,等.電針“內(nèi)關(guān)”穴預(yù)處理對缺血再灌注大鼠心肌的保護作用[J].針刺研究,2010,35(3):182-187.

[3] Gao J, Fu W, Jin Z, et al. Acupuncture pretreatment protects heart from injury in rats with myocardial ischemia and reperfusion via inhibition of the β1-adrenoceptor signaling pathway[J]. Life Sci, 2007, 80(16):1484-1489.

[4] 萬麗麗,夏家紅,劉金平.兩種兔可控性急性心肌缺血再灌注模型的比較[J].中華實驗外科雜志,2009,26(1):118-119.

[5] 林文注,王佩.實驗針灸學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1994: 286-290.

[6] 趙宇輝,孫忠人,魏運芳.針灸預(yù)處理對缺血再灌注大鼠心肌Bcl-2mRNA和BaxmRNA基因表達的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2009,37 (1):16-18.

[7] 黃日龍,韓數(shù),秦黎虹,等.電針預(yù)處理對再次心肌缺血模型家兔心肌酶的影響[J].針刺研究,2012,37(3):224-228.

[8] 李曉艷,宋春華,劉爾林,等.針刺預(yù)處理對心肌缺血大鼠細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、CasDase-3表達影響的研究[J].中醫(yī)藥信息, 2013,30(6):96-98.

[9] 陳采益,徐斌,喻曉春,等.電針經(jīng)穴與相應(yīng)非經(jīng)穴對大鼠心動過緩調(diào)節(jié)效應(yīng)差異的研究[J].上海針灸雜志,2010,29(12):747-751.

[10] 王欣,王月蘭,陳業(yè)農(nóng),等.針刺心經(jīng)經(jīng)脈對家兔心力環(huán)面積和交感神經(jīng)心中支放電活動的影響[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010, 29(3):32-35.

[11] 吳松,王華,李佳,等.電針不同穴位對心肌肥厚模型大鼠炎癥細胞因子的比較研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(2):260-262.

[12] 李萬山,鐘敏,楊進輝,等.電針“內(nèi)關(guān)”穴預(yù)處理對缺血再灌注大鼠心肌阿片受體基因表達的影響[J].中國針灸,2011,31(5): 441-445.

[13] 林海波,嚴潔,常小榮,等.針灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對兔缺血再灌注損傷心肌細胞死亡受體通路Fas/FasL蛋白表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(5):1285-1290.

Effect of Pretreatment with Electroacupuncture at Point Neiguan(PC6) on CK and Myocardial Cell Activity in Rabbit Myocardial Ischemia and Reperfusion

WANG Chao, ZHANG Jia-li, LIU Zhao, LIU Mi, YAN Jie, CHANG Xiao-rong, GUO Li-na, AI Kun. Hunan University of traditional Chinese medicine,Changsha 410007,China

ObjectiveTo investigate the effect of pretreatment with electroacupuncture at point Neiguan(PC6) on CK and myocardial cell activity in rabbit myocardial ischemia-reperfusion injury and provide an experimental basis for a relatively specific relationship between pericardium meridian points and the heart.MethodsForty New Zealand big ear rabbits were randomly allocated to groups A, B, C, D and E, eight rabbits each. Group A was a sham operation group. Group B was an ischemia-reperfusion model group, in which the left anterior descending coronary artery was occlude for 30 min and reperfused for 60 min. In groups C, D and E, points Neiguan(PC6), Lieque(LU7) and Hegu(LI4) were separately given electroacupuncture stimulation, 20 min every day, at seven days before model making. Creatine kinase (CK) and myocardial formazan contents were compared between the groups.ResultsThere were statistically significant differences in serum CK and myocardial formazan contents between group B, C, D or E and group A (P＜0.01, P＜0.05). There was a statistically significant differences in serum CK content between group C, D or E and group B (P＜0.01). There was a statistically significant differences in myocardial formazan content between groups C and B (P＜0.05). There were statistically significant differences in serum CK and myocardial formazan contents between group D or E and group C (P＜0.01, P＜0.05). Conclusion Electroacupuncture at point Neiguan(PC6) can reduce myocardial ischemia-reperfusion induced injury to myocardial cells to produce a protective effect on the heart.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Myocardial reperfusion injury; Creatine kinase; Myocardial cell activity; Point, Neiguan(PC6); Point, Lieque(LU7); Point, Hegu(LI4); Rabbit

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.01.0067

2014-09-23

1005-0957(2015)01-0067-03

國家自然科學(xué)基金項目(81072868,81102661);湖南省科技廳課題(2013sk3086)

王超(1974 - ),女,副教授,碩士生導(dǎo)師,E-mail:592436380@ qq.com

嚴潔(1941 - ),女,教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:yj5381159 @126.com