己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

李泉源 魏澗 嚴(yán)禮琴 王群

己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

李泉源 魏澗 嚴(yán)禮琴 王群

目的 探討己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)與臨床意義。 方法 收集2002年7月至2009年7月在我院接受手術(shù)治療的71例乳腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本，所有腫瘤組織均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)己糖激酶-Ⅱ蛋白在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)，并探討其表達(dá)量與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。 結(jié)果 乳腺癌組織中己糖激酶-Ⅱ的陽(yáng)性表達(dá)率為70.4%，顯著高于癌旁正常乳腺組織中的11.3% (P<0.05)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，己糖激酶-Ⅱ的陽(yáng)性表達(dá)情況與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、分化程度和病理類(lèi)型無(wú)關(guān)，與患者的有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)(P<0.05)；己糖激酶-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)的患者5年生存率顯著低于陰性表達(dá)的患者(P=0.026)。 結(jié)論 己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯升高，對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后判斷具有重要意義。

乳腺癌； 己糖激酶-Ⅱ; 靶向治療

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，在我國(guó)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)[1]，目前在臨床上主要采取以手術(shù)為主,輔以化療、放療和內(nèi)分泌治療的綜合性治療。近年來(lái)隨著乳腺癌改良根治術(shù)的逐步推廣，手術(shù)切除范圍的縮小，化療已經(jīng)成為乳腺癌治療中的常規(guī)性手段[2]。然而，現(xiàn)有的化療藥物存在較大的細(xì)胞毒性，因此，尋找新型、高效的靶向性藥物對(duì)于其治療具有重要意義。己糖激酶-Ⅱ(Hexokinase Ⅱ)已經(jīng)證實(shí)在多種腫瘤組織中高表達(dá)，本文通過(guò)研究其在乳腺癌組織中的表達(dá)，以期為乳腺癌的治療提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2002年7月至2009年7月在我院接受手術(shù)治療并經(jīng)過(guò)術(shù)后病理證實(shí)的乳腺癌患者71例，入選患者年齡35～79歲，平均(56.0±7.6)歲，分別選取乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織各71塊進(jìn)行分析。本研究經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。收集的資料包括患者姓名、年齡、術(shù)前術(shù)后輔助檢查的結(jié)果、病理分期和治療情況等。本研究對(duì)象中排除術(shù)前接受過(guò)放療、化療治療的患者，所有患者每隔2月通過(guò)電話或者來(lái)院隨訪，隨訪期限為5年。

1.2 免疫組織化學(xué)和HE染色 取乳腺癌術(shù)中切除的新鮮腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，行常規(guī)石蠟包埋，石蠟標(biāo)本行4 μm厚連續(xù)切片，60 ℃烤片8 h備用。將石蠟切片脫蠟和水化，PBS沖洗3次，每次3 min。蒸餾水浸泡沖洗后行抗原修復(fù)，用EDTA緩沖液100 ℃修復(fù)20 min，自然冷卻至室溫。蒸餾水沖洗2次后，PBS沖洗2次，每次3 min。滴加過(guò)氧化酶阻斷溶液，室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加動(dòng)物非免疫血清，室溫孵育10 min，傾去。滴加一抗己糖激酶-Ⅱ(購(gòu)自美國(guó)santa cruz公司，1∶50稀釋)，室溫孵育60 min，陰性對(duì)照用PBS代替。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加生物素標(biāo)記的二抗 (美國(guó)santa cruz公司，羊抗兔IgG)，室溫孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加5 μl鏈霉菌抗生物素一過(guò)氧化物酶溶液，室溫孵育30 min。PBS沖洗3次，每次3 min。DAB顯色劑顯色。自來(lái)水沖洗后，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。HE染色按照標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

免疫結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照以往文獻(xiàn)[3-4]，采用半定量積分法，由3位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師分別判讀，采用雙盲法對(duì)每張切片在高倍鏡下(×400)計(jì)數(shù)15個(gè)視野，平均100個(gè)細(xì)胞中己糖激酶-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)作為陽(yáng)性細(xì)胞率。免疫組化陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。最終結(jié)果判定：0～2分為陰性，3分為陽(yáng)性；陽(yáng)性細(xì)胞的百分比判斷標(biāo)準(zhǔn): 0～5%為陰性表達(dá)，6%～25%為弱陽(yáng)性，26%～75%為中度陽(yáng)性，>76%為強(qiáng)陽(yáng)性，弱陽(yáng)性、中度陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性定義為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采取χ2檢驗(yàn)，用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 己糖激酶-Ⅱ蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá) 乳腺癌組織中己糖激酶-Ⅱ的染色主要為胞漿陽(yáng)性，染色為淡黃色、棕黃色和棕褐色，己糖激酶-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞在癌旁正常組織中明顯減少 (圖1)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌組織中的陽(yáng)性率高達(dá)70.4%(50例)，顯著高于癌旁正常乳腺組織的11.3%(8例)(P<0.05)。

圖1 乳腺癌和癌旁正常組織中己糖激酶-Ⅱ的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果(×400)

2.2 己糖激酶-Ⅱ蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 己糖激酶-Ⅱ的陽(yáng)性表達(dá)率與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、病理分型和分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)，與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 己糖激酶 Ⅱ與乳腺癌患者臨床病理特征間的關(guān)系(n,n=71)

組別己糖激酶Ⅱ陽(yáng)性例數(shù)陰性例數(shù)P年齡(歲)<5019120.14≥50319腫瘤大小<3cm30120.92≥3cm209病理分型導(dǎo)管癌26100.97小葉癌146髓樣癌72混合癌33TNM分期Ⅰ期5100.004Ⅱ期197Ⅲ期264分化程度高分化1050.61中分化2210低分化186淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有2630.006無(wú)2418

2.3 己糖激酶-Ⅱ蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系 己糖激酶-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)的患者中位生存期為32月，陰性表達(dá)的患者中位生存期為52.5月。己糖激酶-Ⅱ陰性表達(dá)的乳腺癌患者5年生存率明顯高于己糖激酶-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)的患者(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 己糖激酶-Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者和陰性表達(dá)患者的Kaplan-Meier生存曲線圖

3 討論

與正常組織相比，腫瘤組織的能量代謝發(fā)生明顯改變：正常的組織細(xì)胞主要通過(guò)葡萄糖的有氧分解獲取能量，腫瘤細(xì)胞內(nèi)由于酶譜的變化，即使在有氧條件下也以無(wú)氧酵解獲取能量[5]。己糖激酶是腫瘤組織中糖酵解的限速酶，在腫瘤組織中其表達(dá)量和活性明顯增加，從而使腫瘤組織在無(wú)氧條件下也能通過(guò)無(wú)氧酵解來(lái)保證足夠的能量來(lái)源[6]。此外，糖酵解的中間產(chǎn)物可以被腫瘤組織利用，用來(lái)合成腫瘤生長(zhǎng)的必要物質(zhì)。己糖激酶是糖酵解的第1個(gè)限速酶，一共有4種亞型，Ⅱ型是胰島素敏感型，正常情況下僅在人體內(nèi)的肌肉和脂肪組織中呈現(xiàn)少量表達(dá)，并且多數(shù)以游離形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，研究發(fā)現(xiàn)在肝癌、肺癌及宮頸癌組織中己糖激酶-Ⅱ的表達(dá)明顯增加，以線粒體結(jié)合型為主，且在腫瘤中心部位的表達(dá)量顯著高于腫瘤周邊部位，與低氧狀態(tài)下誘導(dǎo)其表達(dá)相關(guān)[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)己糖激酶-Ⅱ的表達(dá)量與腫瘤的惡性程度存在顯著正相關(guān)性[3]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)己糖激酶-Ⅱ在腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展和侵襲中發(fā)揮重要的作用，靶向己糖激酶-Ⅱ的治療已經(jīng)成為多種腫瘤治療的熱點(diǎn)[8]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)量明顯升高，這與以往研究結(jié)果一致[9]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中己糖激酶-Ⅱ的表達(dá)與患者的臨床分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與年齡、分化程度、病理類(lèi)型無(wú)關(guān)，說(shuō)明己糖激酶-Ⅱ升高是乳腺癌腫瘤組織中的共性，同時(shí)是影響患者的臨床預(yù)后的重要因素，目前，已經(jīng)研發(fā)出多種己糖激酶-Ⅱ的抑制劑，最近的一項(xiàng)研究表明己糖激酶-Ⅱ的選擇性抑制劑3-BrPA可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞中ATP的產(chǎn)生和上調(diào)氧化應(yīng)激的水平[10]，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡[11]，提示靶向己糖激酶-Ⅱ的藥物對(duì)于乳腺癌的治療可能具有重要意義，未來(lái)需要在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究己糖激酶-Ⅱ?qū)θ橄侔┑闹委熥饔茫云跒榕R床上乳腺癌的治療打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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Expression of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma and correlation with the clinicopathologic characteristics

LIQuan-yuan,WEIJian,YANLi-qin.DepartmentofBreastSurgery,DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China;WANGQun.TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China

Objective To investigate the expression of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma, and to discuss the relationship between positive expression and clinical characteristics of breast carcinoma. Methods Seventy-one patients with breast carcinoma in our hospital from July 2002 to July 2009 were included in this study. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma and normal tissues. All the specimens were confirmed by pathology. The correlation between the expression of Hexkinase Ⅱ and clinical characteristics of patients was analyzed. Furthermore, survival analysis was performed to study the relation between expression levels of Hexokinase Ⅱ and prognosis. Results The positive expression rate of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma and normal tissues was 70.4% and 11.3% respectively. Statistical analysis demonstrated that the positive expression rate of Hexokinase Ⅱ showed no significant correlation with age, histologic type, degrees of pathdogical differentiation and tumor size, but was related to clinical stage and lymph node metastasis (P< 0.05). According to the survival analysis the Hexokinase Ⅱ positive-expression group showed poorer overall survival rate compared with negtive-expression group (P=0.026). Conclusions The expression of Hexokinase Ⅱ is increased in breast carcinoma, and holding certain reference value for estimating prognosis of breast carcinoma patients.

breast carcinoma; Hexokinase Ⅱ; target treatment

湖北省教育廳課題(Q20132107)

442000湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院乳腺外科(李泉源，魏澗，嚴(yán)禮琴)；442000湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院(王群)

魏澗，Email：weij4203@163.com

R 541.6

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.07.018

2014-09-15)