消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片抗感染的體外實驗研究*

曹洪張磊錢煒肖慶芳鄒海兵*

消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片抗感染的體外實驗研究*

曹洪張磊錢煒肖慶芳鄒海兵*

目的 探討消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片體外抗骨感染效果。方法 應(yīng)用溶劑混懸揮發(fā)法制備骨植入緩釋片，觀察其對金黃色葡萄球菌標準菌株（S.aureus ATCC 25923）、大腸埃希菌標準菌株（Escherichia coli ATCC 25922）、銅綠假單胞菌標準菌株（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）的抑菌效果。結(jié)果消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片在46天實驗時間內(nèi)對S.aureus ATCC25923、EscherichiacoliATCC25922、Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853有良好的抑菌效果。結(jié)論消旋聚乳酸可作為藥物緩釋系統(tǒng)的一種可降解材料載體，為可降解材料治療骨感染提供了新的思路。

消旋聚乳酸；左氧氟沙星；緩釋；骨髓炎

化膿性骨髓炎（Suppurative osteomyelitis）是由化膿性細菌感染引起的病變，包括骨膜、骨密質(zhì)、骨松質(zhì)及骨髓組織的炎癥。文獻報道，根據(jù)創(chuàng)傷及其處理的不同，其發(fā)病率可達2%～15%[1,2]。由于骨組織血供差，加之死骨、死腔的形成，全身應(yīng)用抗生素往往難以在局部形成有效抗菌濃度，且長時間靜脈用藥還會增加抗生素的全身毒、副作用[3]。因此，骨髓炎的抗生素治療一直是棘手的問題。雖然慶大霉素-骨水泥珠鏈作為骨髓炎局部治療的經(jīng)典一直在沿用，但其亦有明顯的缺點。例如藥物釋放完以后需二次手術(shù)拔鏈等[4]。為解決這一矛盾，人們研究、開發(fā)了一系列生物可降解材料來作為抗生素局部釋放載體，以期避免上述缺點。消旋聚乳酸（Poly-D,L-lactide）就是其中研究、應(yīng)用非常成熟的一個突出代表[5,6]。本課題組在前期工作中已經(jīng)在體內(nèi)實驗證實其抗骨感染的有效性[7]，本實驗擬在體外實驗證實其抗感染作用。

1 材料和方法

1.1 材料

消旋聚乳酸購自山東省醫(yī)療器械研究所（分子量80 kDa,=0.7），左氧氟沙星原料藥由浙江新華制藥有限公司能提供（國藥準字H20094174）。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌菌株由湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院檢驗科提供，分別為：S.aureusATCC25923、EscherichiacoliATCC25922、PseudomonasaeruginosaATCC27853。分光光度儀Nanodrop 2000c（Thermo Fisher Scientific,US）。

1.2 制備方法

按前期工作溶劑混懸揮發(fā)法制備消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片[7,8]：將消旋聚乳酸剪碎，稱取相應(yīng)重量的消旋聚乳酸置四氫呋喃溶液中緩慢加熱溶解，至完全溶解后按消旋聚乳酸：左氧氟沙星重量比3:1再加入相應(yīng)重量的左氧氟沙星粉末，將二者的混合物充分研勻后放入烤箱中60℃加熱1小時促四氫呋喃揮發(fā)，取出后常溫下再放置8小時使殘余的四氫呋喃完全揮發(fā)（注意使四氫呋喃充分揮發(fā)）。將完全干燥的混合物從容器上刮下，適當剪碎。稱取混合物120mg（左含氧氟沙星30mg）加入預(yù)制的金屬模具中，將模具連同其中的混合物置烤箱中90℃加熱10分鐘，取出模具置于壓片機中300 kg壓力下壓模，取出模具放入乳膠手套中，再將乳膠手套置自來水中快速冷卻，冷卻后脫模，制成消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片。塑料袋封裝，60Co 25 KGy消毒備用。

1.3 體外釋放實驗

配制0.02%w/v、pH值為7.3的等滲磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution,PBS），分別將不含消旋聚乳酸的左氧氟沙星粉末和消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片置于PBS緩沖液中24小時，24小時后取樣，在分光光度儀 Nanodrop2000c下，先激發(fā)左氧氟沙星粉末懸液，讀取峰值，再讀取消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋懸液的峰值。

1.4 體外抑菌實驗

將制備好的消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片9枚，每3枚為一組，分別置于接種有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的瓊脂糖培養(yǎng)基中央（一個培養(yǎng)皿中只放置1枚藥片），37℃培養(yǎng)24小時后測量抑菌圈大小。然后將藥片轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中每3天更換新的培養(yǎng)基并測量一次抑菌圈，如此重復至實驗后46天。另取與含藥藥片同樣大小、形狀及共混比例的不含左氧氟沙星的消旋聚乳酸緩釋片于上述各菌種培養(yǎng)基中做為空白對照。

2 結(jié)果

2.1 溶劑混懸揮發(fā)法制備骨植入緩釋片的結(jié)果

加熱條件下四氫呋喃能夠?qū)⑾廴樗岢浞秩芙?，隨后加入的左氧氟沙星粉末也能溶于四氫呋喃。左氧氟沙星粉末在攪拌、研磨過程中可均勻地分散于消旋聚乳酸、四氫呋喃溶液中。隨著四氫呋喃室溫下的快速揮發(fā)，消旋聚乳酸-左氧氟沙星共混物呈貼附于容器壁上并逐漸干燥。共混材料在模具中加熱至90℃后，兩者間無分相現(xiàn)象發(fā)生。在300kg的壓力下，模具中的消旋聚乳酸和左氧氟沙星共混材料相互緊密粘結(jié)，迅速冷卻后順利脫模，制成所需形狀的圓形藥片。藥片淡黃色、表面光滑、質(zhì)地均勻，質(zhì)硬、有韌性，不易碎裂（圖1），其直徑為6mm，厚度為2.36mm。

圖1 制備成的消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片。圖A，D消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片正面觀；圖B消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片側(cè)面觀；圖C不含左氧氟沙星的聚乳酸緩釋片正面觀

2.2 體外釋放實驗結(jié)果

在分光光度儀Nanodrop2000c下，左氧氟沙星粉末懸液的最大吸收峰值為287nm，消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋懸液的最大吸收峰值也為287nm，見圖2（彩圖見插頁）。

圖2 消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片體外釋放實驗。圖A左氧氟沙星粉末在分光光度儀下最高吸光峰為287nm；圖B消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片在分光光度儀下最高吸光峰也為287nm

2.3 體外抑菌實驗結(jié)果

消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片在體外抑菌實驗46天的時間范圍內(nèi)，分別對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌產(chǎn)生了抑菌圈，對各菌抑菌圈的最大值都出現(xiàn)在抑菌實驗的第一天，抑菌圈直徑分別為（30.2±2.4）mm，（36.3±1.7）mm和（27.1±2.1）mm。不含氧氟沙星的片對上述各菌種均未形成抑菌圈。（圖3彩圖見插頁）

圖3 消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片體外抑菌實驗。圖A不含左氧氟沙星粉末的緩釋片不形成抑菌圈；圖B消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片對S.aureus ATCC 25923產(chǎn)生了抑菌圈；圖C消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片對Escherichia coli ATCC 25922產(chǎn)生了抑菌圈；圖D消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片對Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853產(chǎn)生了抑菌圈

3 討論

常見的骨科非特異性感染包括骨髓炎和人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染，時代的不同賦予了骨科感染不同的特點。據(jù)統(tǒng)計，閉合性骨折感染率為0～1%；開放性骨折感染率為0～11%[9]，其中尤以開放性骨折、內(nèi)固定失當、急性骨髓炎歸轉(zhuǎn)、低毒性細菌感染或來自炎性病灶細菌血源性播散等原因造成的非明顯大塊死骨形成的慢性骨感染在臨床上較為常見。雖然手術(shù)技術(shù)不斷創(chuàng)新，抗菌素不斷更新?lián)Q代，但是對其治療仍沒有滿意的解決方案，因為軟組織經(jīng)過創(chuàng)傷和炎癥的雙重毀損，清創(chuàng)后很難滿足足夠的軟組織覆蓋以達到良好的血管化作用，全身使用抗菌素通過血源性播散無法有效到達感染的骨間室部位[10]。局部應(yīng)用植入型抗生素緩釋系統(tǒng)，具有在病變部位容易產(chǎn)生有效的抗生素治療濃度、藥物釋放時間長、全身毒副作用小等優(yōu)點，是目前較為理想的治療骨感染的方法?？股毓撬酁槟壳芭R床應(yīng)用最多的局部植入型抗生素釋放系統(tǒng)[11]，為非生物降解型[12]。上世紀年代應(yīng)用于臨床以來，對骨關(guān)節(jié)感染的治療起到積極的作用，但隨著其長期應(yīng)用人們發(fā)現(xiàn)作為抗生素載體存在許多缺陷[13]，如藥物釋放不完全不能降解吸收，需二次手術(shù)取出鏈珠等[14]。因此，人們致力于新的抗生素釋藥系統(tǒng)-可生物降解材料抗生素釋藥系統(tǒng)的研究，以期避免載體的缺點，更好地發(fā)揮局部抗生素釋藥系統(tǒng)的作用[15,16]。

消旋聚乳酸（Poly-D,L-lactide）是以乳酸為主要原料聚合得到的聚合物，可生物降解，已廣泛用于骨科內(nèi)固定和手術(shù)縫合線等，并有學者將其做為藥物的載體[17]。引起慢性骨髓炎的常見病原菌為葡萄球菌類如金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性桿菌類如大腸桿菌、銅綠假單胞菌，結(jié)合目前常用的局部釋放抗生素包括氨基甙類、喹諾酮類和 內(nèi)酰胺類[18]，我們選用左氧氟沙星（levofloxacin）作為共混材料之一，左氧氟沙星是喹諾酮類抗菌藥，具有廣譜抗菌作用，抗菌作用強，其體外抗菌活性約為氧氟沙星的兩倍。作用機制是通過抑制細菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性，阻止細菌DNA的合成和復制而導致細菌死亡，在臨床抗感染治療中表現(xiàn)出多方面的優(yōu)越性，發(fā)揮了重要的作用。

體外釋放實驗中，左氧氟沙星粉末懸液的最大吸收峰值為287nm，消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋懸液的最大吸收峰值也為287nm，這說明消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片能釋放左氧氟沙星，仔細觀察峰譜，除287nm外，沒有多余峰譜，這也從另一方面證明消旋聚乳酸是一種良好的可降解生物材料，在降解過程中，不會產(chǎn)生其它異物。

金黃色葡萄球菌是化膿性骨髓炎的最常見致病菌。一般來說，對骨感染的治療已被證實需要使用抗生素4～6周[19]，本實驗中，消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片在體外抑菌實驗46天的時間范圍內(nèi)，分別對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌產(chǎn)生了抑菌圈，達到了連續(xù)給藥4～6周的要求，并且適用范圍廣泛。后續(xù)實驗中我們會進一步開展體內(nèi)實驗以驗證其有效性。

總之，本實驗證明消旋聚乳酸可作為藥物緩釋系統(tǒng)的一種可降解材料載體，消旋聚乳酸-左氧氟沙星骨植入緩釋片在體外抑菌實驗中表現(xiàn)出良好的抗感染效果，并且達到了連續(xù)給藥4～6周的要求，這些為可降解材料治療骨感染提供了新的思路。

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Poly-D,L-Lactide and Levofloxacin-Blended beads to treat osteomyelitis in vitro

Objective This study described the biodegradable material poly-D,L-lactide could be used as a potential antibioticcarrier forlocal drugrelease.MethodsPoly-D,L-lactidewasfirst dissolvedintetrahydrofuranfollowedbyblending with levofloxacin in a physical way.The blend was then molded into beads.The beads with the best ratio were chosen forbacteriostasis intriplicate inoculatedwithS.aureusATCC 25923,Escherichia coli ATCC25922,Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 every 3 days until 46 days.Results In vitro tests of drug release and bacteriostasis demonstrated that the beads released high concentrations of antibiotic for the period of time（i.e.,46 days）,which is needed to treat bone infection.Conclusion Poly-D,L-lactide as a drug carrier could be a potentially effective method for clinical local drug release,this study suggest that Poly-D,L-lactide as antibiotic beads for the sustained delivery system.All of these are desirable in a drug sustained delivery system for preventing or treating osteomyelitis.

Poly-D,L-lactide;Levofloxacin;Sustained delivery system;Osteomyelitis

R318；R683

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2015.05.004

swgk2015-05-00104

曹洪（1982-）男，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：骨關(guān)節(jié)外科。

*[通迅作者]鄒海兵（1970-）男，碩士，主任醫(yī)師。研究方向：骨與關(guān)節(jié)損傷。

2015-05-22）

湖北省科學技術(shù)廳資助項目（2013CFC031）；湖北省衛(wèi)生計生科研基金資助項目（WJ2015Q042）

湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，湖北十堰442000