L16(45)正交實驗優(yōu)化黃刺玫花黃酮物質(zhì)提取工藝

李 強，李慶超，周長征△

1山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2中國石油大學(華東)

L16(45)正交實驗優(yōu)化黃刺玫花黃酮物質(zhì)提取工藝

李 強1，李慶超2，周長征1△

1山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2中國石油大學(華東)

目的：采用有機溶劑提取法研究不同影響因素對黃刺玫花中黃酮類物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化。方法：實驗室選用蘆丁作為標準對照，有機溶劑乙醇提取后紫外分光光度法測定其內(nèi)部的黃酮含量做評價，實驗選取紫外光照射時間、水浴溫度、溶劑體積比、提取時間、提取次數(shù)等進行正交實驗的方法學考察，做出最佳工藝流程。結果：最佳提取工藝為紫外光照射20分鐘、水浴溫度70℃、乙醇體積分數(shù)為80%、料液比1∶20，提取2次。結論：選用該方法操作簡便、原理簡單、得率較高、藥效成分穩(wěn)定性較好，為黃酮類物質(zhì)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供必要的相關依據(jù)。

正交實驗；黃刺玫花；黃酮類；提取工藝

黃刺玫屬薔薇科薔薇屬野生落葉喬木，分布于中國的廣大北方地區(qū)［1-2］，尤在東北三省、山西、內(nèi)蒙古等地分布廣泛。古代醫(yī)書上記載黃刺玫的花、葉、皮及其果實等部位都可以作為中藥使用，可理氣調(diào)經(jīng)，健脾活血，用于治療腹脹腹痛以及女性月經(jīng)不調(diào)等疾?。?］，也可做觀賞。有關文獻研究表明，黃刺玫的果實及皮中含有大量的黃酮類、皂苷及其超氧化物歧化酶等物質(zhì)［4］，經(jīng)鑒定黃酮類物質(zhì)主要為蘆丁。查找文獻發(fā)現(xiàn)近10年對黃刺玫各部位的研究較少，本文利用實驗研究黃刺玫花中的黃酮類物質(zhì)的更為高效合理的提取工藝，為其廣泛地應用于工業(yè)化生產(chǎn)提供必要的理論基礎。

1 材料

1.1 材料 黃刺玫花采自山東中醫(yī)藥大學校園內(nèi)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學藥學院高德民教授鑒定為此類植物的花，分為5組，黑暗條件下分別紫外燈照射0、10、20、30、40分鐘，陰干后粉碎過80目篩，低溫避光，密封保存。

1.2 儀器 紫外線消毒車(山東新華醫(yī)療器械公司提供)；UV-6000型紫外分光光度計(上海元析儀器公司提供)；BS210S型電子天平(北京賽多利斯天平股份有限公司提供)；旋蒸儀(上海亞榮儀器總廠提供)。

1.3 試劑 蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所提供)；乙醇；亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉。

2 黃刺玫花黃酮類物質(zhì)的測定

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇 按照2.3中相關數(shù)據(jù)進行下述方法提取，用乙醇提取總黃酮時含量最高，相對來說采用乙醇效果較好。見表1。

表1 不同提取溶劑的黃酮提取效率

2.1.2 提取方法的選擇 按照2.3中的相關數(shù)據(jù)進行總黃酮的提取，乙醇提取明顯優(yōu)于其他方法，提取效率較高，效果最佳，采用此法可行。見表2。

表2 不同提取方法的黃酮提取效率

2.2 蘆丁回歸方程的制作

2.2.1 紫外吸收波長的測定 無風封閉條件準確稱取干燥的蘆丁對照品21.8 mg，以80%乙醇充分溶解振蕩混勻并定容于200 mL容量瓶內(nèi)，此時標準品的濃度為0.109 mg/mL，冷藏備用。以試劑作空白對照，蘆丁對照品和黃刺玫花提取液進行200～510 nm的紫外全波長掃描，結果顯示在500nm處吸收最大。見表3。

表3 蘆丁標準曲線數(shù)據(jù)

2.2.2 回歸方程的制備 用移液管分別精密移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于6只10 mL容量瓶中，各加0.3 mL5%亞硝酸鈉于容器內(nèi)，混勻放置5分鐘；再加入0.3 mL10%硝酸鋁于容器內(nèi)混勻放置5分鐘；加入1 mol/L氫氧化鈉3 mL后搖勻放置10分鐘定容至刻度。在500 nm波長處測量(見表3)，以吸光度為橫坐標X，以標準溶液濃度為縱坐標Y得到回歸方程為Y=0.029 5X+0.003 2 (R2=0.999 1)，濃度范圍0.00545～0.03264mg/mL。

2.3 黃刺玫花總黃酮的提取測定 精密稱取6份干燥黃刺玫花粉末1 g于100 mL容量瓶，一定溫度下加入一定體積分數(shù)的乙醇加熱1個小時進行提取合并，提取液抽濾，活性炭吸附雜質(zhì)并減壓濃縮至膏狀，80%乙醇定容至20 mL作供試品備用。精密量取上述各供試品0.1 mL于10 mL容量瓶中，按“2.1.3”項下的步驟進行，于500 nm處進行紫外吸收測定，可獲得該部位總黃酮的含量。

2.4 穩(wěn)定性實驗 常溫常壓下，分別取6份樣品放置5、10、15、20、25、30、40分鐘后，測其吸光度A，結果顯示，放置20分鐘后吸光度開始降低。因此實驗數(shù)據(jù)應在加入顯色劑后20分鐘內(nèi)測試。

2.5 精密度實驗 取此類相同藥材提取物各4份，按照2.3試驗方法顯色后測定黃酮含量，藥物中平均含量為29.37 mg/g，RSD為0.82%，數(shù)據(jù)表明實驗的精密度較好。

2.6 回收率實驗 在此藥材的已知含量的提取液中，加入一定含量的蘆丁標準品，按照測定的方法測定蘆丁的含量為94.52%，RSD為1.12%。

2.7 正交實驗設計 依據(jù)相關文獻，選定提取時間1小時為恒定指標，研究紫外光照射時間A、體積分數(shù)B、料液比C、水浴溫度D、提取次數(shù)E等對總黃酮提取效果的影響，每個因素下設4個水平，見表4，進行正交試驗設計，以總黃酮的得率作為評價指標，對該部位總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化。

3 結果

按照表4的因素利用正交設計進行上述各因素的提取條件進行篩選，結果見表5。

表4 正交實驗單因素水平

表5 L16(45)正交實驗結果

［2］ 李萍.野生黃刺玫的開發(fā)利用［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2010(6): 30-31.

［3］ 楊權勤.正交法在醫(yī)藥學科研中的應用［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1992.

［4］ 葉松華，王曉燕，楊瑩瑩，等.黃刺玫果中總黃酮的提取工藝研究［J］.山西醫(yī)科大學學報，2013，44(7):535-538.

4 討論

根據(jù)對表格進行直觀的分析，并結合不同因素的多重比較結果，黃刺玫花中總黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝為A3B2C4D3E2，即最佳的提取工藝為紫外光照射20分鐘、水浴溫度70℃、乙醇體積分數(shù)為80%、料液比1∶20，提取2次。上述各單因素對總黃酮的提取的影響大小依次為C＞A＞D＞B＞E，即乙醇體積分數(shù)＞紫外光照射時間＞料液比＞水浴溫度＞提取次數(shù)。使用本提取工藝，可以減少乙醇的使用量，減低能耗減少成本，提高黃酮的提取效率，對于工業(yè)生產(chǎn)有一定的指導意義。

［1］ 山西植物志編纂會.山西植物志［M］.北京：中國科技出版社，1998(4)：335-337.

Flavonoids Extraction Process of Rosa Xanthina Optimized
by L16(45)Orthogonal Experiment

LI Qiang1,LI Qingchao2,ZHOU Changzheng1△
1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;
2 China University of Petroleum

Objective:To choose different influencing factors to optimize the extraction process of flavonoids from rosa xanthina by adopting organic solvent extraction method.Methods:Rutin was chosen as standard substance in the experiment,after organic solvent extraction method,the contents of flavonoids in rutin were detected by ultraviolet spectrophotometry and assessed,ultraviolet light,water bath temperature,volume ratio,extracting time and extracting times were selected to design the best extraction process.Results:The optimal extraction processing was: to irradiate 20 minute under the ultraviolet light,70℃as water bath temperature,volume fraction of ethanol as 80%, feed liquid ratio as 1:20,extracting times as two times.Conclusion:The method is easy to operate,simple,with high yield and good stability of active ingredients,it provides necessary reference for mass industrial production of the flavonoids.

orthogonal experiment;rosa xanthina;flavonoids;extraction process

R284.2

A

1004-6852(2015)10-0059-03

2015-05-16

李強(1990—)，男，在讀碩士研究生。研究方向：藥物新劑型與新技術的研究。

△通訊作者：周長征(1966—)，男，教授。研究方向：藥物新劑型與新技術的研究。