叉頭框蛋白Q1在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系

王 斌，張 遜,耿 華，徐美林，周海英

(1.天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床學(xué)院胸外科 300140；2.天津胸科醫(yī)院胸外科 300051；3.天津胸科醫(yī)院病理科 300051；4.唐山工人醫(yī)院胸外科，河北唐山 063000)

論著·臨床研究

叉頭框蛋白Q1在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系

王 斌1，張 遜2△,耿 華3，徐美林3，周海英4

(1.天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床學(xué)院胸外科 300140；2.天津胸科醫(yī)院胸外科 300051；3.天津胸科醫(yī)院病理科 300051；4.唐山工人醫(yī)院胸外科，河北唐山 063000)

目的 研究人非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤組織中叉頭框蛋白Q1(FOXQ1)的表達(dá)水平,探討其與NSCLC患者的臨床病理特征相關(guān)性,及其對(duì)患者預(yù)后的影響。方法 選擇天津市胸科醫(yī)院2007年6月至2008年12月期間術(shù)后病理為NSCLC患者石蠟標(biāo)本共84例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色SP法檢測(cè)患者腫瘤組織中FOXQ1蛋白的表達(dá)水平。分析FOXQ1蛋白的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)、NSCLC患者生存時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果 FOXQ1在腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率為91.7%(77/84)。FOXQ1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與NSCLC患者的病理類(lèi)型、臨床分期均密切相關(guān)(P<0.05)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示：病理分型、臨床分期以及FOXQ1蛋白表達(dá)水平均是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)。結(jié)論 FOXQ1蛋白在NSCLC患者腫瘤組織中高表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。

肺腫瘤；癌，非小細(xì)胞肺；預(yù)后；叉頭框蛋白Q1

肺癌是世界范圍內(nèi)病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌病理類(lèi)的80%，已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病[2]。盡管肺癌治療方法取得了巨大進(jìn)步，但肺癌患者5年生存率僅有16%，在5年內(nèi)估計(jì)有35%～50%的早期NSCLC患者死亡[3]。叉頭框(forkhead，F(xiàn)OX)蛋白是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與多種生物學(xué)過(guò)程，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)展有關(guān)。最新研究提示FOXQ1是FOX基因家族中又一與腫瘤相關(guān)的重要成員[4]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)SP法的方法，觀察NSCLC患者組織中FOXQ1蛋白的表達(dá)情況，探討其對(duì)NSCLC患者的臨床病理特征及預(yù)后的影響，為進(jìn)一步研究FOXQ1蛋白應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇天津市胸科醫(yī)院2007年6月至2008年12月期間術(shù)后病理為NSCLC患者石蠟標(biāo)本共84例。其中，男55例，女29例，年齡35～78歲，平均(55.2±3.16)歲；癌癥類(lèi)型：腺癌43例，鱗癌22例，其他類(lèi)型19例；病理分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期25例，Ⅲ期27例，Ⅳ期15例；分化類(lèi)型：高分化31例,中分化25例,低分化28例。隨訪時(shí)間為3～63個(gè)月，隨訪率為98.8%。截止隨訪結(jié)束,存活24例,死亡60例,死亡原因?yàn)槟[瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,患者術(shù)前均未進(jìn)行化療及放療。所有患者手術(shù)標(biāo)本均用10%甲醛固定，石蠟包埋，所有患者的臨床及病理資料完整。

1.2 方法

1.2.1 SP染色 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法，烤片，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水。阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3% H2O237 ℃孵育10 min，PBS沖洗后進(jìn)行抗原修復(fù)。山羊血清37 ℃孵育10 min；滴加FOXQ1抗體(工作濃度為1∶500)50 μL，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗5 min×3。滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃30 min，PBS沖洗，5 min×3；DAB顯色。自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，干燥，封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.2 SP染色結(jié)果判定 FOXQ1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒，也有少量胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，故以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。F0XQl染色結(jié)果由專(zhuān)業(yè)病理科醫(yī)師評(píng)估，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及著色面積綜合評(píng)定。細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí)：無(wú)著色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。著色面積按照陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率分為以下4級(jí)：≤25%為1分；>25%～≤50%為2分；>50%～≤75%為3分；>75%為4分。用兩者得分和進(jìn)行判斷：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽(yáng)性(+),4～5分為陽(yáng)性(++)，6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.2.3 隨訪方法 隨訪采取門(mén)診復(fù)查和電話相結(jié)合的方式，所有復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的病例均經(jīng)臨床影像或病理學(xué)證實(shí)。隨訪日期:2007年6月1日至2013年12月31日，生存期的計(jì)算從手術(shù)日期到隨訪截止日期，或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。

1.2.4 數(shù)據(jù)比較 SP染色結(jié)果得出后，分析FOXQ1蛋白的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)、NSCLC患者生存時(shí)間的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法進(jìn)行分析，生存曲線采用Kaplan-Meier，并用Log rank進(jìn)行檢驗(yàn)。采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行預(yù)后多因素分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SP染色結(jié)果 FOXQ1陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)為棕黃色或棕褐色染色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于細(xì)胞核(圖1)。84例樣本中，定義積分大于4分為強(qiáng)陽(yáng)性,FOXQ1表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性56例(66.7%)，弱陽(yáng)性21例(25.0%)，陰性7例(8.3%)，陽(yáng)性表達(dá)率為91.7%。

A：弱陽(yáng)性鱗癌；B：強(qiáng)陽(yáng)性鱗癌；C：弱陽(yáng)性腺癌；D：強(qiáng)陽(yáng)性腺癌。

圖1 SP檢測(cè)不同病理類(lèi)型肺癌組織中FOXQ1 的表達(dá)(SP×400)

2.2 FOXQ1蛋白的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 FOXQ1蛋白的表達(dá)與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙史以及腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤分化程度存活狀態(tài)無(wú)關(guān)(P>0.05)。與肺癌的分期、病理類(lèi)型密切相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 84例NSCLC患者臨床病理參數(shù)與FOXQ1蛋白表達(dá)的關(guān)系

續(xù)表1 84例非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理參數(shù)與FOXQ1蛋白表達(dá)的關(guān)系

2.3 FOXQ1蛋白的表達(dá)與NSCLC患者生存時(shí)間的關(guān)系 84例NSCLC總體中位生存時(shí)間為15個(gè)月。FOXQ1表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性者(56例)中位生存時(shí)間為12.5個(gè)月；弱陽(yáng)性者(21例)中位生存時(shí)間為23.8個(gè)月，前者生存時(shí)間顯著短于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.564,P=0.001)。生存曲線見(jiàn)圖2。

圖2 FOXQ1蛋白的表達(dá)與NSCLC患者生存時(shí)間的關(guān)系

2.4 COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)后分析 根據(jù)單因素分析結(jié)果，以性別、年齡、病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及FOXQ1表達(dá)水平為自變量，以患者生存時(shí)間為因變量，應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)OXQ1蛋白表達(dá)水平、病理分型和臨床分期均是影響預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的COX多因素分析

3 討 論

FOX蛋白家族是是一類(lèi)DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)，它是維持細(xì)胞生命活動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)控因子[5]。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，不同胚層或同一胚層的不同部位都有特征性的FOX基因表達(dá)，從而參與細(xì)胞的分化和代謝，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，因此FOX蛋白可作為治療靶點(diǎn)[6]。FOXQ1作為FOX基因家族成員之一，定位于第6號(hào)常染色體短臂25．3區(qū)(6p25.3)，全長(zhǎng)2 319 bp，僅含1個(gè)外顯子，編碼403個(gè)氨基酸。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)FOXQ1基因在不同腫瘤類(lèi)型中作用截然不同。如FOXQ1在黑素瘤中隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展表達(dá)逐漸下調(diào)[7]，在乳腺癌癌旁和正常組織中低表達(dá)，而在乳腺癌組織中表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性[8]。Kaneda等[9]研究發(fā)現(xiàn)：FOXQ1 mRNA在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)；FOXQ1能正向調(diào)控基因的表達(dá)，從而對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管生成起促進(jìn)作用。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中FOXQ1是一種致癌基因，其表達(dá)與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。在胃癌中，F(xiàn)OXQ1表達(dá)水平可作為不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[11]。

本研究結(jié)果顯示，84例NSCLC患者中，處于癌癥中晚期、病理分型差的患者，其腫瘤組織中FOXQ1蛋白表達(dá)水平較高，腫瘤進(jìn)展期FOXQ1蛋白表達(dá)水平要高于腫瘤早期，這提示FOXQ1蛋白的表達(dá)水平與腫瘤惡性程度密切相關(guān)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、分化程度與FOXQ1蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯相關(guān)性，原因可能與本研究的樣本量偏小有關(guān)，還需要大樣本進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)。根據(jù)生存曲線本研究發(fā)現(xiàn)：FOXQ1陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間(OS)顯著短于FOXQ1陰性表達(dá)的患者(P=0．001)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析的結(jié)果顯示：臨床分期、病理分型和FOXQ1蛋白的表達(dá)水平是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因素(均P<0．05)。

近年來(lái)，肺癌發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈急劇上升趨勢(shì)，在許多國(guó)家肺癌的發(fā)病率和病死率均已居各種惡性腫瘤的首位[12]。靶向治療已逐漸成為NSCLC治療的新選擇，腫瘤增殖過(guò)程中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和其他生物學(xué)途徑可作為NSCLC預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)。本研究證實(shí)FOXQ1在NSCLC 組織中高表達(dá)，且與不良預(yù)后有關(guān)。目前對(duì)FOXQ1作用機(jī)制的研究仍然處于初級(jí)水平，對(duì)其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。探究FOXQ1作用的分子機(jī)制是今后研究的熱點(diǎn)方向，進(jìn)一步探索FOXQ1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)和分子學(xué)機(jī)制，將有助于更好地闡述NSCLC的生物學(xué)行為，而下調(diào)FOXQ1基因的表達(dá)可能成為NSCLC治療的新思路。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]Nordquist LT,Simon GR,Cantor A,et al.Improved survival in never-smokers vs current smokers with primary adenocarcinoma of the lung[J].Chest,2004,126(2):347-351.

[3]Gao W,Liu LX,Lu X,et al.Circulating MicroRNAs:possible prediction biomarkers for personalized therapy of Non-Small-Cell lung carcinoma[J].Clin Lung Cancer,2011,12(1):14-17.

[4]Feuerborn A,Srivastava PK,Kiiffer S,et al.The forkhead factor FOXQl influences epithelial differentiation[J].J Cell Physiol,2011,226(3):710-719.

[5]Chen K,Rajewsky N.The evolution of gene regulation by transcription factors and microRNAs[J].Nat Rev Genet,2007,8(2):93-103.

[6]Hannenhalli S,Kaestner KH.The evolution of Fox genes and their role in development and disease[J].Nat Rev Genet,2009,10(4):233-240.

[7]Jensen EH,Lewis JM,Mcloughlin JM,et al.Down-regulation of pro-apoptotic genes is an early event in the progression of malignant melanoma[J].Ann Surg Oncol,2007,14(4):1416-1423.

[8]Zhang HJ,Meng FY,Liu G,et al.Forkhead transcription factor Foxq1 promotes Epithelial-Mesenchymal transition and breast cancer metastasis[J].Cancer Res,2011,71(4):1292-1301.

[9]Kaneda H，Arao T，Tanaka K，et aL.FOXQ1 is overexpressed in colorectal cancer and enhances tumor genicity and tumor growth[J].Cancer Res,2010,70:2053-2063.

[10]Wang WW,He S,Ji JL,et al.The prognostic significance of FOXQ1 oncogene overexpression in human hepatocellular carcinoma[J].Pathol Res Pract,2013,209(6):353-358.

[11]Liang SH,Yan XZ,Wang BL,et al.Increased expression of FOXQ1 is a prognostic marker for patients with gastric cancer[J].Tumor Biology,2013,34(5):2605-2609.

[12]Dearing KR,Sangal A,Gj W.Maintaining clarity:Review of maintenance therapy in non-small cell lung cancer[J].World J Clin Oncol,2014,5(2):103-113.

Expression and relationship between forkhead box Q1 and prognosis in NSCLC

WangBin1,ZhangXun2△,GengHua3,XuMeilin3,ZhouHaiying4

(1.DepartmentofThoracicSurgery,FourthCentralClinicalHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300140,China;2.DepartmentofThoracicSurgery,TianjinChestHospital,Tianjin300051,China;3.Departmentofpathology,TianjinChestHospital，Tianjin300051,China;4.DepartmentofThoracicSurgery,TangshanWorkers′Hospital,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To study the expression of forkhead box Q1(FOXQ1)in non-small cell lung cancer(NSCLC),then investigate clinical pathological characteristics of NSCLC and its prognosis in patients.Methods The expression of FOXQ1 in 84 cases of NSCLC(selected from June 2007 to December 2008 )was detected by immunohistochemistry(SP).The correlations of the expression of FOXQ1 with clinic pathological features and survival time of the NSCLC patients were analyzed.Results The positive expression rate of FOXQ1 was 91.7%(77/84),closely correlated with patients`histological type and TNM stage(P<0.05).The Cox multivariate analysis demonstrated that histological type,TNM stage and FOXQ1expression were independent factors of NSCLC(P<0.05).Conclusion The expression of FOXQ1 may be highly expressed in NSCLC and negatively correlated with prognosis.

lung neoplasms；carcinoma,non-small cell lung;prognosis;foxhead box Q1

王斌(1977-)，主治醫(yī)師，在讀博士，主要從事肺癌基礎(chǔ)方向研究。△

,Tel:18602212679;E-mail：zhangxun69@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.01.022

R655.3

A

1671-8348(2015)01-0063-03

2014-08-24

2014-10-22)