單純性胰腺創(chuàng)傷后大鼠胰腺細(xì)胞增殖狀況的實(shí)驗(yàn)研究*

陳光宇，戴睿武，羅 皓，陳振宇，陳 濤，黎冬暄，呂潤華，湯禮軍

(成都軍區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心，成都 610083)

論著·基礎(chǔ)研究

單純性胰腺創(chuàng)傷后大鼠胰腺細(xì)胞增殖狀況的實(shí)驗(yàn)研究*

陳光宇，戴睿武△，羅 皓，陳振宇，陳 濤，黎冬暄，呂潤華，湯禮軍

(成都軍區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心，成都 610083)

目的 構(gòu)建大鼠單純性胰腺創(chuàng)傷模型觀察胰腺細(xì)胞增殖變化特點(diǎn)并探討胰腺細(xì)胞增殖與組織損傷的關(guān)系。方法 將60只Wistar大鼠分為2組：撞擊組(采用BIM-Ⅲ生物撞擊機(jī)構(gòu)建胰腺創(chuàng)傷大鼠模型，40只)和對照組(假手術(shù)組，20只)，每組大鼠于建模后6、24、72 h,7 d處死，采用分光光度法檢測各組大鼠血清淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)活性，通過TUNEL染色和流式細(xì)胞技術(shù)測定胰腺組織細(xì)胞死亡并分析細(xì)胞周期分布特點(diǎn)，Western blot測定胰腺組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果 撞擊組大鼠LPS活性升高時(shí)相點(diǎn)晚于AMS且持續(xù)時(shí)間較長，TUNEL染色、流式細(xì)胞檢測、Western blot結(jié)果揭示胰腺創(chuàng)傷可誘導(dǎo)胰腺組織細(xì)胞凋亡和代償性增生。胰腺細(xì)胞增殖變化特點(diǎn)表明胰腺創(chuàng)傷后的最佳治療時(shí)間是發(fā)病24 h內(nèi)。結(jié)論 同時(shí)檢測AMS和LPS有助于判定胰腺的外分泌功能受損情況。

模型，動物；細(xì)胞增殖；胰腺創(chuàng)傷；Bcl-2；Bax

隨著交通事故的頻發(fā)及可產(chǎn)生較強(qiáng)沖擊波的現(xiàn)代武器的廣泛應(yīng)用，胰腺創(chuàng)傷的發(fā)病率逐年上升。胰腺是一類具有分泌功能的實(shí)質(zhì)性臟器，胰腺創(chuàng)傷后可引起出血、胰瘺、炎癥、創(chuàng)傷后胰腺炎的發(fā)生，病死率高達(dá)20%[1-2]。目前針對胰腺創(chuàng)傷的研究關(guān)注于其診治方法，而胰腺創(chuàng)傷后的病理生理變化尚不完全清楚。本研究前期實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了一種模擬單純性胰腺創(chuàng)傷的大鼠模型[3]，為了進(jìn)一步了解胰腺創(chuàng)傷后大鼠胰腺細(xì)胞增殖變化特點(diǎn)，進(jìn)行了以下研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑 實(shí)驗(yàn)使用健康雄性SPF級Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，平均(208.9±8.5)g，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動物研究所提供。戊巴比妥鈉購于美國Sigma公司，血清淀粉酶(amylase,AMS)、脂肪酶(lipase,LPS)測定試劑盒購于南京建成公司，TUNEL染色試劑盒購于瑞士Roche公司，細(xì)胞周期檢測試劑盒購于美國BD公司，兔抗大鼠Bcl-2、Bax購于美國Santa Cruz公司，β-actin內(nèi)參抗體購于上?？党晒?，辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購于武漢博士德公司，ECL發(fā)光試劑盒購于美國Millipore公司，組織蛋白提取試劑盒及BCA蛋白定量測定試劑盒購于南京碧云天公司。

1.2 動物分組及模型制備 所有大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為撞擊組(40只)和對照組(20只)，將每組大鼠平均分為4個(gè)小組，分別于建模后6、24、72 h,7 d處死各小組大鼠。所有大鼠建模前禁食12 h，建模后任意進(jìn)食飲水。動物模型制備方法如下，(1)撞擊組：給予3%戊巴比妥鈉(0.1 mL/100 g)麻醉大鼠后取腹壁正中切口，在胰腺下方墊一小塑料片，用BIM-Ⅲ生物撞擊機(jī)產(chǎn)生400 kPa恒定壓力氣流沖擊胰腺組織[3]構(gòu)建胰腺創(chuàng)傷大鼠模型。(2)對照組：僅行開腹手術(shù)，翻動胰腺數(shù)次后關(guān)腹。

1.3 檢測指標(biāo)及方法 每組大鼠分別于建模后腹腔動脈采血處死，留取血清、胰腺組織待測。

1.3.1 血清相關(guān)指標(biāo)檢測 AMS、LPS活性按試劑盒說明采用分光光度法檢測。

1.3.2 TUNEL法檢測胰腺細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，胰腺細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞，每張切片在400倍鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.3 流式細(xì)胞技術(shù)觀察胰腺細(xì)胞凋亡和增生 參考文獻(xiàn)[4]所述方法，應(yīng)用細(xì)胞周期檢測試劑盒(碘化丙啶染色)在流式細(xì)胞儀上用FlowJo程序分析G0/G1期，S期和G2/M期細(xì)胞分布情況并計(jì)算出增殖指數(shù)(proliferation index,PI)[參考公式：PI= (S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)× 100%]，同時(shí)通過該軟件檢測AI。

1.3.4 Western blot檢測胰腺組織Bcl-2、Bax的表達(dá) 參照組織蛋白提取試劑盒說明提取胰腺組織蛋白并用BCA法測定蛋白濃度；Western blot操作過程如下：用上樣針吸取20 μg蛋白至十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳凝膠上進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PDVF)膜(購于美國Roche公司)，隨后將PVDF膜置于質(zhì)量濃度5 g/mL脫脂牛奶中封閉1 h，然后在4 ℃下分別用Bcl-2(1∶500)、Bax抗體(1∶500)和β-actin內(nèi)參抗體(1∶2 000)孵育過夜，再分別將膜放入含有二抗(1∶1 000)的脫脂牛奶中孵育3 h，用ECL顯色液顯影于感光膠片上，最后用UVP Biospectrum 410凝膠成像系統(tǒng)對Western blot目的條帶掃描后進(jìn)行分析，蛋白含量以條帶的光密度值(Int)×面積(mm2)表示，以此代表Bcl-2和Bax的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 血清相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果 建模后撞擊組大鼠6、24、72 h、7 d存活率分別為100%、80%、70%、70%，對照組大鼠均存活。血清AMS活性：撞擊組大鼠血清AMS活性在建模后6 h迅速升高，建模后24 h達(dá)最高值，在建模72 h急劇下降；撞擊組大鼠血清LPS活性在建模后6 h也開始上升，建模后72 h達(dá)最高值，建模后7 d恢復(fù)正常值；這提示胰腺創(chuàng)傷后大鼠血清LPS活性升高晚于AMS，但其升高持續(xù)時(shí)間長于AMS；對照組各時(shí)相點(diǎn)間大鼠血清AMS和LPS活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 胰腺細(xì)胞凋亡和增殖情況 TUNEL染色與流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果都提示撞擊組各時(shí)相點(diǎn)大鼠胰腺細(xì)胞AI在建模后6 h最高，隨后逐漸下降，但均較對照組高；撞擊組大鼠胰腺細(xì)胞PI在建模后6 h降低，建模后24 h則顯著上升，建模后7 d達(dá)最高值；對照組各時(shí)相點(diǎn)間大鼠AI和PI差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1，表2、3。

2.3 Western blot檢測胰腺組織Bcl-2、Bax表達(dá) 采用UVP Biospectrum 410圖像分析系統(tǒng)測出各條帶的光密度值半定量顯示出Bcl-2、Bax在胰腺組織內(nèi)的表達(dá)情況，撞擊組大鼠胰腺組織Bcl-2表達(dá)隨時(shí)間推移逐漸增強(qiáng)，而Bax的表達(dá)則隨時(shí)間推移逐漸減弱，對照組大鼠胰腺組織各時(shí)相點(diǎn)Bcl-2、Bax表達(dá)無明顯差異，見圖2、表4。

表1 建模后各組大鼠血清中AMS、LPS活性

a：P<0.05,與撞擊組同期比較;b：P<0.05，與前一時(shí)相點(diǎn)組內(nèi)比較。

A:對照組；B：撞擊組建模后6 h；C:撞擊組建模后24 h;D:撞擊組建模后72 h;E:撞擊組建模后7 d;胰腺細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。

圖1 各時(shí)相點(diǎn)大鼠胰腺細(xì)胞凋亡情況檢測(TUNEL染色×400)

表2 建模后各組大鼠

表3 建模后各組大鼠胰腺細(xì)胞增殖情況

表4 建模后各組大鼠胰腺組織Bcl-2、Bax的表達(dá)

a：P<0.05，與同組上一時(shí)間點(diǎn)比較。

A:對照組；B：撞擊組建模后6 h；C:撞擊組建模后24 h;D:撞擊組建模后72 h;E:撞擊組建模后7 d。

圖2 Western blot檢測撞擊組胰腺組織Bcl-2、Bax的表達(dá)

3 討論

本研究中參照前有方法[3]構(gòu)建了大鼠胰腺創(chuàng)傷模型并觀察胰腺創(chuàng)傷7 d內(nèi)的相關(guān)生理變化。研究發(fā)現(xiàn)胰腺創(chuàng)傷后的早期階段(6～24 h)大鼠活動減少，僅保持基本生命活動的被動體位。創(chuàng)傷后24～72 h，多數(shù)大鼠已逐漸開始進(jìn)食及活動，創(chuàng)傷后72 h至7 d時(shí)，大鼠均存活并能完成正常生理活動，這說明24 h內(nèi)是胰腺創(chuàng)傷的危險(xiǎn)時(shí)段，胰腺創(chuàng)傷的相關(guān)治療應(yīng)盡早進(jìn)行。血清胰酶活性的檢測結(jié)果提示撞擊組大鼠血清AMS活性在早期即升高但持續(xù)時(shí)間短，而LPS活性升高出現(xiàn)較晚而持續(xù)時(shí)間長，這種現(xiàn)象與通過注射雨蛙素等化學(xué)方法誘導(dǎo)大鼠急性胰腺炎的酶學(xué)變化類似[5-6]。通過對酶學(xué)結(jié)果的分析，作者認(rèn)為同時(shí)測定血清AMS和LPS活性有助于評估胰腺的外分泌功能[7]。

細(xì)胞凋亡是胰腺疾病的一種保護(hù)性反應(yīng)[8]。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，它們能產(chǎn)生同源二聚體化和異源二聚體化，這兩種蛋白之間的比例決定了凋亡的發(fā)生[9-10]。TUNEL染色和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示AI在胰腺創(chuàng)傷早期階段(6 h)即升高達(dá)極值并隨時(shí)間推移逐漸下降。本研究利用Western blot技術(shù)檢測Bax和Bcl-2的表達(dá)來評估機(jī)體調(diào)控細(xì)胞死亡的能力。結(jié)果表明撞擊組大鼠胰腺組織內(nèi)Bax的表達(dá)在創(chuàng)傷后6 h最強(qiáng)，此時(shí)Bcl-2的表達(dá)則較弱。Bax的表達(dá)在創(chuàng)傷后24 h均逐漸減弱，而Bcl-2的表達(dá)則隨時(shí)間推移逐漸增強(qiáng)?；谝陨辖Y(jié)果作者推斷胰腺細(xì)胞凋亡活動在胰腺創(chuàng)傷后早期(6 h以前)增強(qiáng)，隨后凋亡小體形成并被吞噬細(xì)胞清除。創(chuàng)傷24 h后，隨著胰腺組織自我修復(fù)和凋亡小體的清除，組織損傷程度逐漸改善，新發(fā)的凋亡細(xì)胞也逐漸減少，故總凋亡細(xì)胞數(shù)降低[11]。以上結(jié)果也提示胰腺創(chuàng)傷干預(yù)的關(guān)鍵時(shí)相點(diǎn)在24 h內(nèi)。

作者利用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期分析了胰腺細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示撞擊組大鼠胰腺細(xì)胞PI在創(chuàng)傷后早期(6 h)有所下降，但與對照組比較無明顯差異，此時(shí)撞擊組大鼠胰腺細(xì)胞AI最高，表明創(chuàng)傷后早期細(xì)胞凋亡最顯著。創(chuàng)傷24 h后，PI逐漸增高，在創(chuàng)傷7 d后達(dá)最高值，但AI卻隨時(shí)間推移而降低。以上AI的變化與TUNEL染色結(jié)果一致，驗(yàn)證了TUNEL染色的結(jié)果，另外也提示在創(chuàng)傷24 h后細(xì)胞增殖修復(fù)機(jī)制已激活，胰腺細(xì)胞的增殖修復(fù)在創(chuàng)傷后期將持續(xù)存在。同時(shí)通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡比率的檢測作者注意到創(chuàng)傷早期(6 h)細(xì)胞凋亡比率較高，但是創(chuàng)傷24 h后凋亡細(xì)胞明顯減少，說明胰腺創(chuàng)傷后存在機(jī)體代償性地抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制，對機(jī)體損傷起到了保護(hù)調(diào)節(jié)作用。

本研究中借助前期建立的大鼠單純性胰腺創(chuàng)傷動物模型探討了胰腺創(chuàng)傷后細(xì)胞增殖的變化規(guī)律。創(chuàng)傷造成胰腺組織破壞可在早期發(fā)生，胰腺細(xì)胞內(nèi)溶酶體破壞后引起胰酶激活是胰腺創(chuàng)傷后細(xì)胞破壞及組織損傷較其他腹腔內(nèi)臟器傷情更重的原因[12]。通過TUNEL染色、流式細(xì)胞儀檢測凋亡發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后24 h胰腺已開始激發(fā)自我修復(fù)機(jī)制。Bcl-2及Bax蛋白的Western blot檢測結(jié)果揭示機(jī)體對胰腺創(chuàng)傷后凋亡的干預(yù)關(guān)鍵時(shí)相點(diǎn)在24 h內(nèi)。最后，流式細(xì)胞儀對PI的檢測驗(yàn)證了細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞增生啟動于胰腺創(chuàng)傷早期，在7 d達(dá)到高峰。確定胰腺創(chuàng)傷后細(xì)胞增殖的變化規(guī)律為以后針對胰腺創(chuàng)傷后治療的相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)。

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Experimental research on the characteristics of pancreatic cells regeneration in an animal model for isolated pancreatic trauma*

ChenGuangyu,DaiRuiwu△,LuoHao,ChenZhengyu,ChenTao,LiDongxuan,LvRunhua,TangLijun

(CenterofGeneralSurgery,GeneralHospitaloftheChinesePeople′sLiberationArmyChengduMilitaryRegion,Chengdu,Sichuan610083,China)

Objective To study the relationships between tissue damage and the ability of the pancreatic cells to regenerate,and analyze the alteration of the pancreatic cells regeneration.Methods Sixty rats were divided into two groups:impact group(the pancreas was injured by a BIM-Ⅲ biotical impact machine,40 rats) and control group(sham operated,20 rats).All rats were sacrificed at 6 h,24 h,72 h,7 d after operation.The level of AMS,LPS in the serum were detected by spectrophotometry,pancreatic cells regeneration were examined and analyzed by TUNEL staining and flow cytomertry,and the Bcl-2 and Bax expression were measured by Western blot.Results In the impact groups,LPS was activated later than AMS,and lasted persistently.The results from TUNEL stain,flow cytometry and Western blot indicated that pancreatic trauma induces cell death and the compensatory proliferation of pancreatic cells.The characteristics of pancreatic cells regeneration in the animal model of isolated pancreatic trauma indicate that the proper remedial time is in the first 24h after the pancreatic trauma.Conclusion Detecting AMS and LPS at the same time can help us to determine the exocrine function of pancrease.

model,animal;cell regeneration;pancreatic trauma;Bcl-2;Bax

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.04.004

國家自然科學(xué)基金(81001695);成都軍區(qū)總醫(yī)院院管課題(2013YG-B065)。 作者簡介：陳光宇(1980-)，醫(yī)師，碩士，主要從事胰腺炎治療研究?！?/p>

,E-mail：rwdai@163.com。

R641

A

1671-8348(2015)04-0442-04

2014-08-18

2014-10-06)