真武膠囊安全性評價研究*

申 安，袁 洋，岳園園，張 穎，李曉天，張玉靜

(1.焦作市食品藥品檢驗所，河南 焦作 454001； 2.大連醫(yī)科大學附屬第一人民醫(yī)院，遼寧 大連 116000； 3.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450000)

真武膠囊安全性評價研究*

申 安1，袁 洋2，岳園園3，張 穎3，李曉天3，張玉靜3

(1.焦作市食品藥品檢驗所，河南 焦作 454001； 2.大連醫(yī)科大學附屬第一人民醫(yī)院，遼寧 大連 116000； 3.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450000)

目的：對真武膠囊的安全性進行研究。方法：取40只KM小鼠進行急性毒性試驗。將小鼠隨機分為對照組和真武膠囊組2組，每組20只。真武膠囊組給予真武膠囊生藥粉57.14g/(kg·d)，對照組給予羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)0.4 g /(kg·d)，灌胃給藥，1d 2次，上、下午各1次，給藥間隔約為6 h，給藥期限為1 d。給藥后觀察動物反應，連續(xù)觀察15 d。另取SD大鼠160只進行長期毒性試驗。將大鼠隨機分為對照組(CMC-Na 0.05 g/kg)，真武膠囊低劑量(1.71g/kg)、中劑量(3.20 g/kg)、高劑量(5.97 g/kg)組4組，灌胃給藥，1 d 1次，每周給藥6 d，連續(xù)給藥90 d。觀察一般狀況，并檢測血液學指標、血液生化學指標，對心臟、氣管、肺和胃組織進行病理學檢查。結果：急性毒性試驗中所有動物均未出現(xiàn)明顯的毒性反應，觀察期結束后對全部動物進行剖檢，肉眼觀察各臟器無明顯異常。長期毒性試驗在給藥后的觀察期內實驗動物一般狀況良好，血液學指標、各臟器組織等均未出現(xiàn)與藥物相關的毒性反應。結論：真武膠囊具有較好的安全性。

真武膠囊/藥效學；安全性；毒性試驗；動物模型；小鼠

真武湯出自《傷寒論》,由附子、生姜、茯苓、白術、白芍組成，是為表證過汗傷陽、少陰病陽虛水泛病證而設的名方[1]。本研究采用新的配方比例首次將真武湯改為膠囊劑型，按照《藥品注冊管理辦法》新藥技術要求，對真武膠囊做臨床前安全性評價。

1 材 料

1.1 動 物

急性毒性試驗用動物：經(jīng)檢疫合格的SPF級KM小鼠40只，雌雄各半,雄性體質量18.8～24.6g，雌性體質量18.0～22.5 g，由河南省實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(豫)2010-0002，實驗動物質量合格證號為1019164。長期毒性試驗用動物：經(jīng)檢疫合格的SPF級SD大鼠160只，雌雄各半，雄性體質量112.0～141.3g，雌性體質量122.5～153.7g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2012-0001，實驗動物質量合格證號11400700022526。

1.2 藥品與試劑

真武膠囊，每粒膠囊含0.4 g膠囊粉，每克膠囊粉相當于8.75 g生藥，由某制藥股份有限公司提供，批號130506。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，由國藥集團化學試劑有限公司提供，批號F20090113。

2 方法與結果

2.1 急性毒性試驗

2.1.1 動物分組與給藥

將40只KM小鼠隨機分為對照組和真武膠囊組2組，每組20只，雌雄各半。真武膠囊組給予真武膠囊生藥粉57.14 g/(kg·d)，對照組給予CMC-Na 0.4 g /(kg·d)，均灌胃給藥，1 d 2次，上、下午各1次，給藥間隔約為6 h ，給藥期限為1 d。

2.1.2 檢測指標

觀察給藥后動物的一般狀況，稱量體質量，記錄動物中毒的表現(xiàn)和特點、毒性反應出現(xiàn)和消失時間，以及動物的死亡時間，并連續(xù)觀察15 d。

2.1.3 結 果

在給藥后的觀察期內，所有動物均未出現(xiàn)明顯的毒性反應，動物無一例死亡。真武膠囊組動物的體質量與對照組對比，差別無統(tǒng)計學意義。觀察期結束后對全部動物進行剖檢，肉眼觀察各臟器無明顯異常。

2.2 長期毒性試驗

2.2.1 動物分組與給藥

將160只SPF級SD大鼠，隨機分為對照組(CMC-Na 0.05 g/kg)、真武膠囊低劑量(1.71 g/kg)、中劑量(3.20 g/kg)、高劑量(5.97 g/kg)組4組，每組40只，雌雄各半[2]。均灌胃給藥，1 d 1次，每周給藥6 d，連續(xù)給藥90 d。

2.2.2 檢測指標

每天進行一般狀況觀察，每周稱量2次體質量，并于給藥90 d時進行血液學、血清生化學以及病理學檢查。病理檢查根據(jù)鏡檢記錄進行分析[3-5]。

2.2.3 統(tǒng)計學方法

2.2.4 結 果

一般狀況及體質量：各用藥組大鼠的一般狀況良好，未見明顯與藥物相關的毒性癥狀。各用藥組大鼠的體質量與對照組對比，差別無統(tǒng)計學意義。

給藥90 d時各組雄性大鼠血液學指標對比：與對照組對比，真武膠囊粉高劑量組RBC水平降低(P<0.01)、HGB水平降低(P<0.05)、PLT增高(P<0.05)，真武膠囊粉中劑量組RBC水平降低(P<0.05)，但以上指標均在正常值范圍內，且未見與給藥劑量及進程的相關性。各用藥組其余指標與對照組比較差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)RBC/(1012·L-1)HGB/(g·L-1)PLT/(109·L-1)WBC/(109·L-1)NEU/%LYM/%對照組0.0512.25±1.90174.10±25.04678.30±322.177.06±3.6117.018±5.2863.59±12.65真武膠囊高劑量組52.210.37±1.07**153.44±8.83*965.11±134.77*5.23±1.3215.66±3.7663.38±12.72真武膠囊中劑量組28.011.52±1.31*166.30±17.71922.00±323.555.40±2.1418.02±5.5766.04±11.83真武膠囊低劑量組15.011.92±0.89165.60±12.61832.50±251.437.98±3.0414.94±4.3172.86±7.39

注：與對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

給藥90 d時各組雄性大鼠血清生化學指標對比：與對照組對比，真武膠囊粉高劑量組TP升高(P<0.05)，但在正常值范圍內，且未見與給藥劑量及進程的相關性。各用藥組其余指標與對照組比較(P>0.05)。見表2。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)ALP/(U·L-1)GGT/(U·L-1)TP/(g·L-1)ALB/(g·L-1)TBiL/(mmol·L-1)對照組0.0545.44±8.01112.60±19.4996.69±37.291.17±0.3069.78±4.3633.41±3.804.64±0.51真武膠囊高劑量組52.242.64±4.39107.50±22.44105.92±14.401.08±0.2665.53±5.97*31.31±4.124.27±0.55真武膠囊中劑量組28.041.73±4.19108.10±15.07102.00±14.251.15±0.3168.23±1.1632.58±2.634.63±0.48真武膠囊低劑量組15.043.96±7.45105.70±15.87108.38±7.571.19±0.3170.21±5.2032.82±3.984.47±0.50

注：與對照組對比，*P<0.05。

給藥90 d時各組雌性大鼠血液學指標對比：與對照組對比，真武膠囊粉高劑量組RBC水平降低(P<0.05)，HGB水平降低(P<0.05)，但二者均在正常值范圍內，且未見與給藥劑量及進程的相關性。各用藥組其余指標與對照組比較(P>0.05)。見表3。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)RBC/(1012·L-1)HGB/(g·L-1)PLT/(109·L-1)WBC/(109·L-1)NEU/%LYM/%對照組0.0510.14±1.96150.30±23.76900.70±240.833.88±1.2415.92±5.7573.08±9.25真武膠囊高劑量組52.29.14±1.06*138.20±12.74*995.90±154.713.63±1.7515.03±3.7876.85±6.02真武膠囊中劑量組28.09.56±1.25145.00±17.51854.60±240.073.67±1.3819.44±5.9370.36±8.36真武膠囊低劑量組15.09.32±2.45138.30±35.38895.10±315.524.33±2.7114.58±5.8870.05±9.05

注：與對照組對比，*P<0.05。

給藥90 d時各組雌性大鼠血清生化學指標對比：與對照組對比，真武膠囊粉高劑量TP升高(P<0.05)，但在正常值范圍內，且未見與給藥劑量及進程的相關性。各用藥組其余指標與對照組比較差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)ALP/(U·L-1)GGT/(U·L-1)TP/(g·L-1)ALB/(g·L-1)TBiL/(mmol·L-1)對照組0.0543.1±5.70102.70±9.18103.10±14.421.22±0.2869.41±3.5332.94±2.484.43±0.60真武膠囊高劑量組52.245.69±3.76106.40±10.54110.57±12.841.34±0.2765.07±5.25*32.76±3.653.88±0.62真武膠囊中劑量組28.045.00±5.92107.80±9.52105.23±15.411.17±0.2469.08±4.8832.27±3.444.31±0.37真武膠囊低劑量組15.043.92±4.61101.92±9.55104.46±11.461.31±0.2375.37±8.4633.57±2.494.45±0.77

注：與對照組TP對比,真武膠囊高劑量組 *P<0.05。

病理檢查結果：動物組織器官未出現(xiàn)與藥物相關的毒性反應，高劑量組大鼠心臟、氣管、肺和胃的病理切片見圖1～4。大鼠心肌纖維條紋清晰，無變性、壞死。氣管黏膜、黏膜下層和外膜結構清楚。肺終末支氣管與肺泡組織結構清晰，肺泡壁與肺泡腔內均無炎性細胞浸潤。胃黏膜皺襞清楚，被覆上皮完整，未見潰瘍、增生等改變。

圖1 心臟的病理切片(HE染色，×40)

圖2 氣管的病理切片(HE染色，×10)

圖3 肺的病理切片(HE染色，×20)

圖4 胃的病理切片(HE染色，×10)

3 討 論

真武膠囊是在傳統(tǒng)真武湯(由附子、生姜、茯苓、白術、白芍組成)的基礎上，進一步完善藥物組方、改變劑型而研制出的藥物，與真武湯的治療作用一致，但較真武湯有服用方便、藥物穩(wěn)定性好等優(yōu)點。為了預測受試物可能引起的臨床不良反應，為臨床試驗中解毒或解救措施提供參考，筆者進行了急性毒性試驗和長期毒性試驗。急性毒性試驗所獲得的信息對重復給藥毒性試驗的劑量設計和藥物臨床試驗起始劑量的選擇具有重要參考價值，并對了解其毒性靶器官和初步闡明藥物的毒性作用具有重要意義。在本實驗條件下，一天內灌胃給予小鼠57.14 g /kg真武膠囊生藥粉(相當于擬用臨床劑量的104.1倍)，所有動物均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應。長期毒性試驗可以用來推測第一次臨床試驗的起始劑量，為后續(xù)臨床試驗提供安全劑量范圍以及為臨床不良反應監(jiān)測及防治提供參考。本實驗條件下，用真武膠囊粉給SD大鼠連續(xù)灌胃90 d，高劑量相當于真武膠囊生藥粉52.2 g/(kg·d) ，相當于臨床用量的85.3倍，各項檢測指標均未出現(xiàn)明顯的劑量及時間依賴性。

本研究結果顯示：真武膠囊組動物均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應，各項血液學和血清生化學指標變化也未見明顯劑量及時間依賴性，各組織器官未發(fā)現(xiàn)異常。表明真武膠囊具有良好的安全性，但其具體臨床安全性還有待于進一步研究。

[1]王均寧,劉更生.真武湯的藥理研究與臨床應用[J].中成藥，1998,20(11):45-46.

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.藥物重復給藥毒性試驗技術指導原則[S].北京：國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品評審中心，2014：53-59.

[3]袁伯俊, 廖明陽, 李波.藥物毒理學試驗方法與技術[M].北京:化學工業(yè)出版社, 2007.

[4]孫勁,徐元宏.SD大鼠常見血液學檢測指標參考范圍的建立[J].臨床輸血與檢驗,2008,10(3):253-255.

[5]鄧雯,陳莉莉,劉晶,等.SPF級SD大鼠血液學及血清生化指標正常值探討[J].毒理學雜志,2010,24(2):174-175.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)08-0061-04 ·實驗研究·

R286

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.08.30

李曉天，教授，博士后，lixt@zzu.edu.cn

河南省科技攻關項目(13210231241)

2015-04-22；

2015-06-23