白藜蘆醇對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血管內(nèi)皮因子表達(dá)的影響

盧錦森，馬中飛，縱何香，葉桂萍，郭利梅，何舒寧，張夢(mèng)琳，陳曉宇

◇藥學(xué)研究◇

白藜蘆醇對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血管內(nèi)皮因子表達(dá)的影響

盧錦森1，馬中飛1，縱何香1，葉桂萍1，郭利梅1，何舒寧1，張夢(mèng)琳1，陳曉宇2

目的探討白藜蘆醇（Res）對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的抗炎作用和對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)水平的影響。方法60只SD大鼠隨機(jī)分正常組（10只）和模型組（50只），模型組左后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑建立AA模型，模型組在建模后12 d再分5組：模型對(duì)照組、Res低劑量組（5 mg／kg）、Res中劑量組（15 mg／kg）、Res高劑量組（30 mg／kg）、陽(yáng)性藥塞來(lái)昔布組（5 mg／kg），給藥16 d后處死大鼠，對(duì)各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織行病理切片、HE染色和VEGF免疫組化染色。觀察滑膜增生、血管翳形成、炎癥滲出、關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞等情況。Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果Res治療組的關(guān)節(jié)病理學(xué)評(píng)分明顯低于模型對(duì)照組，免疫組化染色以及Western blot結(jié)果顯示，Res能降低滑膜組織VEGF表達(dá)水平。結(jié)論Res有改善大鼠關(guān)節(jié)滑膜炎癥、抑制滑膜組織VEGF表達(dá)的作用，這可能與Res治療AA關(guān)節(jié)炎有關(guān)。

佐劑性關(guān)節(jié)炎；白藜蘆醇；血管內(nèi)皮因子；大鼠

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的慢性、系統(tǒng)性的自身免疫性關(guān)節(jié)疾病，持久反復(fù)發(fā)作的滑膜炎導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘廢［1］。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型是一種RA免疫性炎癥模型，RA和AA存在許多類似之處，且造模方法簡(jiǎn)單易行，是目前較常用的RA動(dòng)物模型，為理想的篩選和研究治療RA藥物的模型［2］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種特異性的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)血管生成［3］。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是存在于葡萄、虎杖、決明、藜蘆等的非黃酮類多酚化合物，具有抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功效［4］。該課題組前期研究［5－6］表明，Res對(duì)AA模型大鼠有一定的治療作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，該研究進(jìn)一步觀察Res對(duì)AA模型大鼠的治療作用，探究這種治療作用是否與抑制滑膜組織VEGF有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑足跖容積測(cè)量?jī)xYLS-TA購(gòu)自山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院；Res（溶于無(wú)菌0.5%羧甲基纖維素鈉中）、弗氏完全佐劑（freund′s complete adjuvant，F(xiàn)CA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗大鼠單克隆VEGF一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；免疫組化二抗、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司；BCA蛋白測(cè)定、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Amersham Life Sciences公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥健康SD大鼠60只，雄性，體重200～210 g，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠自由攝食飲水，飼養(yǎng)于室溫（25±2）℃。隨機(jī)將SD大鼠分為兩組：正常組（10只）、模型組（50只）。模型組于每鼠左后足趾皮內(nèi)注射0.1 ml FCA致炎。于致炎第12天，模型組隨機(jī)均分為5組：模型對(duì)照組、Res低、中、高劑量（5、15、30 mg／kg）組、陽(yáng)性藥塞來(lái)昔布組（5 mg／kg），每4 d稱重1次并根據(jù)體重調(diào)整用藥劑量，連續(xù)灌胃給藥16 d，正常組及模型對(duì)照組給予等劑量溶媒的0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.3 關(guān)節(jié)炎評(píng)分參照先前建立的方法［3］，自AA模型大鼠致炎后12天，每4 d測(cè)定一次關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，觀察大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎病變的嚴(yán)重程度。每爪評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，0分：正常；1分：踝關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹；2分：踝關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和中度腫脹；4分：踝關(guān)節(jié)重度腫脹，最大評(píng)分12分。大鼠非致炎側(cè)右踝關(guān)節(jié)以下的容積變化的繼發(fā)性炎癥采用排水法測(cè)定，腫脹度（Δml）＝致炎后容積－致炎前容積。于致炎起第28天處死所有大鼠，每組大鼠中隨機(jī)選擇4只大鼠，用手術(shù)器械截?cái)嗨闹兤げ⑵溆檬灠褚詡浜罄m(xù)形態(tài)學(xué)相關(guān)檢查，每組剩余6只大鼠迅速取踝關(guān)節(jié)滑膜組織，與液氮罐中冷藏，以備后續(xù)相關(guān)蛋白檢測(cè)。

1.4 踝關(guān)節(jié)滑膜組織免疫組化和VEGF血管計(jì)數(shù)按照SP試劑盒操作說明書，4%多聚甲醛固定大鼠踝關(guān)節(jié)，脫鈣、脫水、石蠟包埋、厚5 μm連續(xù)切片，免疫組化SP法染色：3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原微波加熱修復(fù)，5%羊血清封閉抗原10 min，滴加50 μl兔抗大鼠VEGF單克隆抗體（濃度1 ∶300），4℃孵育過夜，滴加50 μl生物素化羊抗兔IgG二抗工作液，37℃孵育30 min，現(xiàn)配DAB染液顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，光鏡下觀察。PBS替代一抗為陰性對(duì)照，光鏡下組織切片呈棕黃色顆粒性沉積區(qū)域?yàn)殛?yáng)性染色部位。參照文獻(xiàn)［5］計(jì)算陽(yáng)性血管分?jǐn)?shù)，200倍光鏡下，每張VEGF免疫組化切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的VEGF陽(yáng)性血管平均光密度（average optical density，OD）值，兩位觀察者獨(dú)立進(jìn)行測(cè)定，誤差小于5%的情況下，取平均值。

1.5 Western blot法測(cè)定VEGF蛋白的表達(dá)液氮中凍存的各組滑膜組織取樣，并將組織樣品于研缽中研磨成勻漿，按照試劑盒說明書配置細(xì)胞裂解液裂解研磨成勻漿的組織，按步驟離心提取蛋白。按BCA試劑盒說明書，測(cè)定每組樣品的總蛋白濃度，按照（樣品∶5×上樣緩沖液＝4∶1）的比例加入5×上樣緩沖液，100℃金屬浴10 min，保存于－20℃冰箱。每組取30 μg總蛋白，在12%SDSPAGE分離膠中電泳，并于350 mA橫流將蛋白轉(zhuǎn)至0.22 μm孔徑的PVDF膜上。用PBST洗滌PVDF膜，并用5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，按照目的蛋白和轉(zhuǎn)染內(nèi)參所在位置剪開膜，目的蛋白部分加入用一抗稀釋液稀釋后的兔抗鼠VEGF（1∶2 000稀釋）10 ml于4℃搖床孵育過夜。轉(zhuǎn)染內(nèi)參部分加入用一抗稀釋液稀釋后的兔抗鼠β-actin抗體（1∶4 000稀釋）10 ml于4℃搖床孵育過夜。次日用5%脫脂奶粉的PBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋）孵育2 h，洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，Image J灰度分析軟件作半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。計(jì)量資料經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)后采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Res對(duì)大鼠繼發(fā)炎癥的影響致炎后第12天模型組大鼠非致炎側(cè)足趾開始腫脹，呈繼發(fā)性病變，呈進(jìn)行性加重右側(cè)和前足腫脹，逐漸行動(dòng)不便，站立不穩(wěn)。與正常組大鼠比較，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的AA模型組大鼠右足較正常組多發(fā)性關(guān)節(jié)評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Res降低了AA模型大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評(píng)分，Res高劑量、陽(yáng)性藥塞來(lái)昔布治療組較Res小劑量組更為明顯，見圖1。

2.2 Res對(duì)AA模型大鼠繼發(fā)性足腫脹的影響與AA模型對(duì)照組比較，Res自用藥8 d后開始發(fā)揮療效，Res（5、15、30 mg／kg）和陽(yáng)性藥塞來(lái)昔布可明顯抑制AA模型大鼠的繼發(fā)性足腫脹，以Res（30 mg／kg）組和塞來(lái)昔布（5 mg／kg）組作用更為明顯。見圖2。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Res對(duì)AA模型大鼠踝關(guān)節(jié)的VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果表明，在AA模型大鼠滑膜襯里層血管內(nèi)皮VEGF呈高表達(dá)；而隨著Res治療濃度的增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白陽(yáng)性反應(yīng)漸減弱，提示Res可降低血管內(nèi)皮VEGF的活性而改善AA模型大鼠的滑膜組織的血供。模型對(duì)照組大鼠OD值（0.38±0.12）明顯高于正常組（0.13±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.962，P＜0.01），與模型對(duì)照組比較，Res治療組（5、15、30 mg／kg）降低了VEGF陽(yáng)性血管OD值（0.29±0.11 vs 0.25±0.09 vs 0.21±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.306、3.126、6.856，P＜0.05），即高劑量Res降低VEGF陽(yáng)性血管OD值更為明顯。見圖3。

2.4 Res對(duì)關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF蛋白表達(dá)的影響與正常組比較，模型組關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)，而Res各劑量組滑膜組織中VEGF蛋白表達(dá)水平低于模型對(duì)照組，但仍高于正常組。與模型對(duì)照組比較，5、15、30 mg／kg Res組和陽(yáng)性藥塞來(lái)昔布（5 mg／kg）組VEGF蛋白明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

血管增生是RA最先出現(xiàn)的病變之一，此時(shí)滑膜的微血管數(shù)量顯著增加，隨著大量細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的釋放，以中性粒細(xì)胞為代表的各類炎細(xì)胞逐漸侵蝕滑膜深處，在血管生成因子的誘導(dǎo)下，滑膜的微血管得以大量生成［6］。不斷生長(zhǎng)的血管和各類炎細(xì)胞、炎性介質(zhì)不斷破壞關(guān)節(jié)滑膜組織，隨著浸潤(rùn)深度的增加，病變逐漸累積軟骨和骨，縱橫交錯(cuò)的血管和滑膜乃至軟骨相互穿插融合，形成滑膜血管翳，豐富的血管為炎性介質(zhì)如白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α的廣泛釋放提供了通道和補(bǔ)給，這些炎性介質(zhì)隨之造成嚴(yán)重的骨質(zhì)破壞和重塑，造成關(guān)節(jié)的畸形和持續(xù)的疼痛。而縱觀整個(gè)過程，增多的血管為炎性介質(zhì)的擴(kuò)散和炎細(xì)胞的浸潤(rùn)提供了便捷的通道，是造成病變的關(guān)鍵原因［7］。因此，能夠促進(jìn)血管生成和增加血管通透性的VEGF在RA整個(gè)病理過程中起著重要作用。

AA模型是一種RA免疫性炎癥模型，該模型的原發(fā)性病變類似急性炎癥模型，繼發(fā)性炎癥表現(xiàn)為以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征性病變的全身遲發(fā)型超敏反應(yīng)，隨著人們對(duì)RA和AA的深入研究，發(fā)現(xiàn)兩者存在許多類似之處：如滑膜增生、血管翳形成及軟骨和骨破壞。且由于造模方法簡(jiǎn)單易行成為了常用的RA動(dòng)物模型，是研究治療RA藥物的理想模型［2，8］。本課題組前期研究［9］表明，AA大鼠關(guān)節(jié)發(fā)生病變后，關(guān)節(jié)滑膜囊充血水腫，以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞不斷向深處浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張導(dǎo)致其通透性下降，大量血漿、細(xì)胞、細(xì)胞因子滲出，滑膜細(xì)胞分泌大量粘液素、纖維素，隨著病變時(shí)間的延長(zhǎng)，在炎性介質(zhì)的刺激下，軟骨和骨不斷被破壞、重塑，同時(shí)出現(xiàn)變性，滑膜細(xì)胞不斷增生造成滑膜肥厚。因此，滑膜組織炎細(xì)胞的浸潤(rùn)在AA模型大鼠關(guān)節(jié)損傷中占重要地位。而滑膜血管通透性和數(shù)量的增加成為了炎細(xì)胞浸潤(rùn)的組織學(xué)基礎(chǔ)。1990年，因美國(guó)哈佛大學(xué)Folkman博士提出的Folkman理論而使得VEGF備受關(guān)注，VEGF基因由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，定位于染色體6p21.3，有著不同的亞型，其中VEGF121、VEGF165和VEGF189在人體內(nèi)表達(dá)。不同的VEGF受體特異性地分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，常見的有VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。當(dāng)VEGF與其受體結(jié)合，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增生，增加血管的通透性，其活性也受到氧含量、細(xì)胞水平、基因水平的多重調(diào)控。在治療RA仍無(wú)理想手段的今天，尋找滑膜血管增生的抑制劑不失為一個(gè)具有美好前景的方向。找到阻抑VEGF的促血管生成作用的物質(zhì)，就可以抑制炎性介質(zhì)的釋放和浸潤(rùn)，減少關(guān)節(jié)的破壞和重塑，抑制滑膜細(xì)胞的增生，從而有效治療RA。Res具有抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功效，由于VEGF能夠通過與特異性受體結(jié)合促進(jìn)血管的生成，增強(qiáng)血管的通透性從而促進(jìn)滑膜組織增生，破壞周圍軟骨和骨，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)Res可以通過下調(diào)VEGF來(lái)發(fā)揮治療RA作用［10］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組大鼠原發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)分從第12～28天均一直明顯低于模型對(duì)照組，且Res（30 mg／kg）組比Res（5 mg／kg）組降低的程度更加明顯。同時(shí)，與模型對(duì)照組比較，治療組可明顯抑制AA模型大鼠的繼發(fā)性足腫脹，以Res（30 mg／kg）和陽(yáng)性藥塞來(lái)昔布（5 mg／kg）治療組作用更為明顯。這說明Res對(duì)AA有明顯的治療作用，且有劑量依賴效應(yīng)。Western blot顯示，Res治療組和陽(yáng)性藥塞來(lái)昔布組滑膜組織中VEGF蛋白表達(dá)水平低于模型對(duì)照組；免疫組化結(jié)果也顯示同樣結(jié)果，在AA模型大鼠滑膜襯里層血管內(nèi)皮VEGF蛋白呈高表達(dá)，隨著Res濃度的增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白陽(yáng)性反應(yīng)逐漸減弱。這說明Res可能通過抑制VEGF的表達(dá)和活性，從而發(fā)揮對(duì)AA的治療作用。

然而，Res是通過什么途徑來(lái)抑制VEGF的表達(dá)，在此途徑中又通過調(diào)控哪些物質(zhì)進(jìn)而影響VEGF的表達(dá)，都是值得思考的問題。Res可以通過下調(diào)促進(jìn)血管新生的VEGF從而抑制血管翳形成，那么Res是否可以通過上調(diào)VEGF的拮抗因子從而下調(diào)VEGF以抑制血管新生來(lái)緩解AA癥狀，這些問題都有待進(jìn)一步研究。

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Effect of resveratrol on expression of VEGF in rats with adjuvant arthritis

Lu Jinsen，Ma Zhongfei，Zong Hexiang，et al
（Dept of Clinical Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of anti-inflammatory and expression level of vascular endothelial growth factor（VEGF）of resveratrol（Res）on synovial tissues in rats with adjuvant arthritis（AA）.Methods60 SD rats were randomly divided into two groups：normal group（10 rats），model group（50 rats）.Model group was injected freund′s complete adjuvant induced arthritis，when the right paw was induced after 12 days and secondary immune-inflammatory feet were swollen，the model rats were randomly divided into 5 groups，and each group had 10 rats AA model，Res low dose group（5 mg／kg），Res middle dose group（15 mg／kg），Res high dose group（30 mg／kg），positive control celecoxib group（5 mg／kg）qd×16.After induced inflammatory paw，the expressions of VEGF in synovial tissue and articular cartilage was detected by immunohistochemistry，VEGF protein content in synovial tissue were detected by Western blot.ResultsRes could inhibit model group rats pathological damage，compared with the AA model group，synovial tissue expression of VEGF was significantly low in the resveratrol-treated groups and celecoxib group.ConclusionRes prevents the pathological changes of the joint degeneration，its mechanism may be invovled regulating the expression of VEGF in synovial tissue of AA rats.

adjuvant arthritis；resveratrol；vascular endothelial growth factor；rats

R-332

A

1000－1492（2015）07－0969－05

2015－04－08接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81373421）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201310366007）

安徽醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)系、2組胚教研室，合肥 230032作者簡(jiǎn)介：盧錦森，男，碩士研究生；

陳曉宇，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chenxy＠ahmu.edu.cn