巨噬細胞金屬彈力酶 缺氧誘導因子-1α及血管內皮生長因子在胃癌中的表達及其意義

石 海 盧 杰 程 芃 張楠楠 許建明 胡乃中

·基礎醫(yī)學·

巨噬細胞金屬彈力酶 缺氧誘導因子-1α及血管內皮生長因子在胃癌中的表達及其意義

石 海 盧 杰 程 芃 張楠楠 許建明 胡乃中

目的探討巨噬細胞金屬彈力酶(HME)、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)及血管內皮生長因子(VEGF)在胃癌中的表達及臨床意義。方法采用免疫組化SP法檢測胃癌及癌旁組織各30個標本中HME、HIF-1α及VEGF的表達情況。結果①HME、HIF-1α和VEGF在胃癌組織中表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②HME的表達與胃癌的血管浸潤和分化程度有相關性, HIF-1α的表達與腫瘤的組織學類型、淋巴結轉移及TNM分期有相關性，VEGF的表達與浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有相關性。③VEGF分別與HME和HIF-1α在胃癌組織中的表達存在密切的相關性。結論胃癌中HME、HIF-1α及VEGF的高表達可能為腫瘤侵襲轉移的機制之一，且這些指標的檢測對于胃癌的早期判斷、干預治療及預測腫瘤的轉移預后有重要的臨床意義。

胃癌；人巨噬細胞金屬彈力酶；缺氧誘導因子-1α；血管內皮生長因子

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率高，病死率占惡性腫瘤的第一位，其早期的診斷、治療、浸潤和轉移是影響預后的主要因素。腫瘤的快速生長必然造成營養(yǎng)成分和氧氣供應不足導致腫瘤缺氧甚至無氧，故腫瘤細胞微環(huán)境缺氧是其共同特征，是腫瘤生長過程中存在的普遍現(xiàn)象。在缺氧微環(huán)境下腫瘤細胞高表達缺氧誘導因子-la[1](Hypoxia induced factor, HIF-1α)。在長期缺氧微環(huán)境刺激下，通過HIF-1α表達增高、調控血管新生(如VEGF，TGF等)及促進細胞發(fā)生上皮間質轉化(如TWIST，E-cadherin等)等途徑，適應缺氧微環(huán)境而促進腫瘤生長和轉移[2]。其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是特異性最高、作用最強的促血管生長因子[3],是誘導腫瘤血管生長最關鍵的因子之一；而巨噬細胞金屬彈力酶(human macrophage metalloelastase, HME)是基質金屬蛋白酶家族(MMPs)中的一員，又稱為MMP-12，其過度表達可以分解纖溶酶原產生血管抑素從而抑制VEGF的作用。故本文通過對HME、HIF-1α及VEGF在胃癌中的表達及相互關系進行探討，為臨床的診斷、治療及預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人Anti-VEGF多克隆抗體、HIF-1α兔抗人多克隆抗體、MMP-12兔抗人多克隆抗體、檸檬酸鹽、免疫組化試劑盒、PBS及DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 組織標本取自2007年6月至2008年1月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院外科手術全切或者次全切除的胃癌組織及距胃癌組織切緣3 cm以外的正常胃黏膜組織各30個。胃癌組織和癌旁組織均再次由病理科醫(yī)生經HE染色鏡檢確認診斷結果。

1.2.2 免疫組化染色 采用常規(guī)免疫組化SP法對石蠟包埋組織切片(厚5 μm )進行MMP-12、HIF-1α和VEGF染色。

1.2.3 結果判定 HIF-1α以細胞質和(或)細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；HME染色陽性位于細胞漿和(或)細胞膜中呈棕黃色，強染時呈棕褐色；VEGF染色陽性主要表達于胞質。采用半定量積分法判斷陽性結果[4]：按染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；高倍鏡(×400)下隨機對每張切片取10個視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞占同類細胞的百分數，細胞陽性率無的為0分，<25%的為1分，25%～50%的為2分，>50%的3分。 二者積分乘積<2為陰性，>2為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用χ2檢驗分析HME、HIF-1α及VEGF的表達，參數間的相關性分析采用2×2列聯(lián)分析進行比較，所有統(tǒng)計分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HME、HIF-1α及VEGF在胃癌及癌旁組織中的表達 HIF-1α在胃癌組織中主要分布細胞質中，少量分布在細胞核中，在癌旁組織中表達大部分為陰性，少數為陽性，染色后呈棕黃色顆粒，強染呈棕褐色；HME和VEGF在胃癌組織中表達主要分布在細胞漿和(或)細胞膜中，在癌旁組織中少量表達，染色后呈棕黃色，強染時呈棕褐色。HME陽性率：在胃癌組織中為70.0%(21/30)，在癌旁組織中為26.7%(8/30)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.279，P<0.05)；HIF-1α陽性率：在胃癌組織中為76.7%(23/30)，在癌旁組織中為16.7%(5/30)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.696，P<0.05)；VEGF的陽性率：在胃癌組織中為73.3%(22/30)，在癌旁組織中為30.0%(9/30)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.279，P<0.05)。詳見表1。

2.2 VEGF、HIF-1α及HME在胃癌中的表達與胃癌臨床病理參數的關系 HME的表達與胃癌的血管浸潤和分化程度存在相關性,與其他臨床病理參數無明顯相關；HIF-1α的表達與腫瘤的組織學類型、淋巴結轉移及TNM分期存在相關性，與其他臨床病理參數無明顯相關；VEGF的表達與浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有相關性，與其他臨床病理參數無明顯相關。詳見表1。

2.3 VEGF與HME及HIF-1α在胃癌組織中表達的關聯(lián)性分析 腫瘤新生血管的形成依賴VEGF的表達[5],本實驗亦分析了胃癌標本中VEGF的表達與HME、HIF-1α的關系，在VEGF和HME的聯(lián)合檢測中發(fā)現(xiàn)兩者均為陽性的為63.3%(19/30)，均為陰性的為20.0%(6/30)；在VEGF陽性表達的例數中HME也表達為陽性的為86.4%(19/22)，在HME陽性表達的例數中VEGF也表達為陽性的為90.5%(19/21)。VEGF和HME在胃癌組織中表達存在關聯(lián) (列聯(lián)分析r=0.510，P<0.05)。在VEGF和HIF-1α的檢測中發(fā)現(xiàn)兩者均為陽性的為70.0%(21/30)，均為陰性的為20.0%(6/30)；在VEGF陽性表達的例數中HIF-1α也表達為陽性的為95.5%(21/22)，在HIF-1α陽性表達的例數中VEGF也表達為陽性的為91.3%(21/23)；VEGF和HIF-1α在胃癌組織中表達存在關聯(lián)(列聯(lián)分析r=0.593,P<0.05)。詳見表2。

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是胃黏膜細胞一系列基因的結構或表達水平改變所積累起來的多因素、多步驟的復雜過程[6]。惡性腫瘤的浸潤和轉移是其重要特征，是導致患者預后不良的主要原因，而血管的生成是惡性腫瘤浸潤、轉移和發(fā)展過程中極為重要的步驟。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強，特異性最高的促血管生長因子，在血管生成中處于核心地位。VEGF是內皮細胞特異性的血管生成因子，具有經典的信號序列[7], VEGF通過直接刺激內皮細胞增殖和遷移發(fā)揮重要作用。本組實驗在胃癌和癌旁組織標本各30個中，胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，說明VEGF與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移有密切的關系。通過對HME、VEGF和HIF-1α的聯(lián)合檢測進行關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)HME的表達與VEGF呈負相關，HIF-1α的表達與VEGF呈正相關，結合患者完整的臨床資料提示：VEGF的表達與浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有相關性，與其他的臨床參數無明顯的相關性。

表1 HME、HIF-1α及VEGF在胃癌及癌旁組織中的表達及臨床意義(例)

表2 HME、HIF-1α及VEGF在胃癌組織中表達的關聯(lián)性分析(例)

腫瘤生長迅速，隨著腫瘤的不斷生長,體積不斷增大，細胞耗氧量也不斷增加，因此缺氧是惡性腫瘤生長過程中普遍存在的現(xiàn)象，是腫瘤微環(huán)境的顯著特征[8]。而在缺氧的微環(huán)境中，HIF-1α是關鍵的氧調節(jié)因子，是腫瘤生長的啟動子。 HIF-1α的活性在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移中起著非常重要的作用[9]。HIF-1α的過表達可調控下游的靶基因如VEGF、糖酵解酶、EPO等產生紅細胞、新生血管等病理生理反應，從而提高腫瘤細胞對缺氧的耐受性，保證有足夠的能量使其增殖，浸潤和轉移。有研究[10]表明，胃黏膜上皮細胞中HIF-1α表達與VEGF表達密切相關。本實驗中，胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，說明HIF-1α與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移有關。通過對VEGF和HIF-1α的聯(lián)合檢測進行關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)兩者在胃癌組織中的表達存在正相關，HIF-1α表達的增加可以促進VEGF的生成，從而促進新生血管的生成。結合患者完整的臨床資料提示：HIF-1α的表達與腫瘤的組織學類型、淋巴結轉移及TNM分期有關，與其他的臨床參數無明顯的相關性。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移是多重因素作用所致，而機體自身免疫監(jiān)控失調是腫瘤形成的基本因素之一，其中巨噬細胞是機體免疫防御體系的主要組成部分。巨噬細胞金屬彈性酶(HME)是由活化的巨噬細胞分泌,它能降解多種細胞外和非細胞外成分[11], 是巨噬細胞穿透基底膜和浸潤腫瘤組織必不可少的一種活性物質，部分瘤細胞也具有分泌巨噬細胞金屬彈力酶的作用。在肝細胞癌組織中，HME表達與癌組織的血供呈負相關，是一個新的影響肝癌患者術后生存時間的獨立預后因素。HMEmRNA過表達，結直腸癌患者的血管浸潤及淋巴結浸潤的發(fā)生率均較低，預后較好。重組MME具有顯著的抑制小鼠原位種植結腸癌生長和微血管生成的作用[12-15]。上述結果均提示HME起著重要的抑制腫瘤進展的作用。國外研究[16]發(fā)現(xiàn)，HME可以分解纖溶酶原產生血管抑素，從而具有抑制微血管內皮細胞增殖的作用。血管抑素主要通過抑制VEGF而抑制新生血管的生成，從而抑制腫瘤的浸潤及轉移。本實驗中，HME在胃癌中的表達明顯高于癌旁組織，說明HME的過度表達與腫瘤的浸潤及轉移有關，通過對VEGF和HME的聯(lián)合檢測進行關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)兩者在胃癌組織中的表達存在負相關，HME的過表達的抑制VEGF的生成，從而抑制新生血管的生成。結合患者完整的臨床資料提示：HME的表達與腫瘤的血管浸潤和分化程度有相關性,與其他的臨床參數無明顯的相關性。

綜上所述，胃癌早期檢出率低，高轉移高侵襲性是其致死率高的主要原因。本實驗發(fā)現(xiàn)，HME、HIF-1α及VEGF在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，并且HME的表達與VEGF呈負相關，HIF-1α與VEGF呈正相關，提示HME、HIF-1α及VEGF在胃癌發(fā)展的進程中均發(fā)揮著一定的作用，為進一步探討胃癌的浸潤、轉移及發(fā)病機制奠定基礎，可作為評價胃癌的早期診斷、浸潤、轉移及預后的指標并為分子靶向治療等提供線索。

[1] Arjumand W, Suitana S. Roie of VHL gene mutation in human renal cell carcinoma[J]. Tumour Bioi, 2012，33(1):9-16.

[2] Noman MZ, Messai Y, Carr T，et al. Microenvironmental hypoxia orchestrating the cell stroma cross talk, tumor progression and antitumor response [J] .Crit Rev Immunol, 2011，31 ( 5):357-377.

[3] Kosem M, Tuncer I, Kotan C, et al. Significance of VEGF and microvascular density in gastric carcinoma[J]. Hepatogastroenterology,2009,56(93):1236-1240.

[4] Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD, et al. Inhibition of apoptosis by surviving predicts shorter survival rates in colorectal cancer[J]. Cancer Res,1998,58(22):5071-5074.

[5] Ribatti D. Cancer stem cells and tumor angiogenesis[J].Cancer Lett,2012,321(1):13-17.

[6] Miyamoto N, Yamamoto H, Taniguchi H, et al. Differential expression of angiogenesis-related genes in human gastric cancers with and those without high-frequency microsatellite instability[J]. Cancer Lett,2007,254(1)：42-53.

[7] Backer MV, Backer JM. Imaging key biomarkers of tumor angiogenesis[J]. Theranostics,2012,2(5):502-515.

[8] Stoeltzing O，McCarty MF，Wey JS，et al．Role of hypoxia-inducible factor 1alpha in gastric cancer cell growth angiogenesis and vessel maturation[J]．J Natl Cancer Inst，2004，96(12)：946-956.

[9] Smith TG，Robbim PA，Ratcliffe PJ．The human side of hypoxia—inducible factor[J]，Br J Haematol，2008，141(3)：325-334.

[10]Liu L, Ning X, Han S, et al. Hypoxia induced HIF-1 accumulation and VEGF expression in gastric epithelial mucosa cell: involvement of ERK1/2 and PI3K/Akt[J].Mol Biol (Mosk)，2008,42(3)：459-469.

[11]Chakraborti S, Mandal M, Das S, et al. Regulation of matrix metalloproteinases：an overview[J]．Mol Cell Biochem，2003，253(1/2)：269-285.

[12]Shi H, Xu JM, Hu NZ，et al. Transfection of mouse macrophage metalloelastase gene into murine CT-26 colon cancer cells suppresses orthotopic tumor growth, angiogenesis and vascular endothelial growth factor expression[J]. Cancer Lett, 2006，233(1): 139-150.

[13]Gorrin-Rivas MJ, Arii S, Mori A, et al. Implications of human macrophage metalloelastase and vascular endothelial growth factor gene expression in angiogenesis of hepatocellular carcinoma[J]. Ann Surg, 2000，231(1):67-73.

[14]Gorrin-Rivas MJ, Arii S, Furutani M,et al. Expression of human macrophage metalloelastase gene in hepatocellular carcinoma: correlation with angiostatin generation and its clinical significance[J]. Hepatology, 1998，28(4):986-993.

[15]Yang W, Arii S, Gorrin-Rivas MJ，et al. Human macrophage metalloelastase gene expression in colorectal carcinoma and its clinicopathologic significance[J]. Cancer, 2001，91(7):1277-1283.

[16]Dong Z, Kumar R, Yang X，et al. Macrophage-derived metalloelastase is responsible for the generation of angiostatin in Lewis lung carcinoma[J]. Cell, 1997，88(6): 801-810.

(2015-03-21收稿 2015-05-01修回)

Expressions and clinical significance of human macrophage metalloelastase, hypoxia induced factor-la and vascular endothelial growth factor in gastric cancer

ShiHai,LuJie,ChengPeng,etal

DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of human macrophage metalloelastase (HME), hypoxia induced factor-la (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in gastric cancer. Methods The expression of HME, HIF-1α and VEGF proteins in 30 specimens of gastric carcinoma and corresponding normal tissues were detected by immunohistochemical SP method, and the correlation of HME, HIF-1α and VEGF and its relationship with clinical pathology were analyzed. Results ①The expression of HME, HIF-1α and VEGF in gastric carcinoma was significantly higher than that of normal gastric tissues, and the difference had statistical significance. ②The expression of HME was significantly associated with blood vessel invasion and the degree of differentiation, nothing to do with other clinic pathological parameters. The expression of HIF-1α was significantly associated with the degree of differentiation, lymph node metastasis and tumor stage. The expression of VEGF was significantly associated with the depth of invasion, lymph node metastasis and tumor stage. ③The expression of VEGF was correlated to that of HME and HIF-1α in gastric carcinoma. Conclusion The expressions of HME, HIF-1α and VEGF show a positive expression in gastric carcinoma. Their expressions are closely related with the angiogenesis, infiltration and transfer, and involved in the occurrence and development of gastric cancer, which may help to explore the mechanism of gastric cancer.

Gastric carcinoma；Human macrophage metalloelastase；Hypoxia induced factor；Vascular endothelial growth factor

上海市衛(wèi)生局科研課題基金資助項目(20124271)

230032 合肥 安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化科(石海，盧杰，張楠楠，許建明，胡乃中) 201900 上海 上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院消化科(程芃)

程芃，shmdah@163.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.07.033