哈尼族驗(yàn)方“莫那奇”對(duì)腦出血模型大鼠神經(jīng)缺損體征及腦組織BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

褚鑫　胡曙華　王國(guó)棟　熊金富　程鵬飛　蔡恩麗

【摘要】目的：探討哈尼族驗(yàn)方“莫那奇”對(duì)大鼠腦出血（ICH）后神經(jīng)缺損體征及腦組織中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的干預(yù)作用。方法：40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組和莫那奇組各10只，以自體血注入法建立大鼠ICH模型，以Berderson評(píng)分法對(duì)其神經(jīng)缺損體征進(jìn)行評(píng)分，應(yīng)用原位雜交方法檢測(cè)干預(yù)后BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化。結(jié)果：與模型組比較，莫那奇組大鼠神經(jīng)缺損體征有一定程度恢復(fù)，腦組織BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。空白組和假手術(shù)組基本無(wú)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。結(jié)論：哈尼族驗(yàn)方“莫那奇”促進(jìn)神經(jīng)缺損體征恢復(fù)和腦組織中BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的增加可能是其治療腦出血后神經(jīng)損傷的重要機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】哈尼族；BDNF；腦出血；腦組織修復(fù)

【中圖分類號(hào)】R29 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）23-0003-02

腦出血（intra cerebral hemorrhage，ICH）是指原發(fā)性腦實(shí)質(zhì)的非創(chuàng)傷性出血，是臨床常見(jiàn)的腦血管疾病。ICH后腦損傷的緩解和治療是臨床實(shí)踐中重要的環(huán)節(jié)[1]，在降低患者致殘率和死亡率、改善患者生活質(zhì)量方面起重要作用。哈尼族驗(yàn)方“莫那奇”在長(zhǎng)期臨床治療ICH中效果顯著，本實(shí)驗(yàn)以ICH大鼠模型作為治療對(duì)象，探討“莫那奇”對(duì)大鼠腦出血（ICH）后神經(jīng)缺損體征及腦組織中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的干預(yù)作用，以揭示其治療ICH的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康成年昆明種SD大鼠40只，雌雄各20只，體重在220～240g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證書號(hào)：SCXK（滇）2011-0004。隨機(jī)分為四組：正常組、假手術(shù)、模型組、莫那奇組各10只。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物先在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境2周，常規(guī)飼養(yǎng)，體重達(dá)到250～280g時(shí)開(kāi)始造模；造模前禁食12h，禁水6h；實(shí)驗(yàn)中，剔除死亡和不合格者，及時(shí)追加動(dòng)物以補(bǔ)充模型。

1.2 儀器設(shè)備與試劑 腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；石蠟切片機(jī)（LEICA，德國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（LEICA，德國(guó)）；手術(shù)器械（上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）；乙醇（成都化學(xué)試劑廠，分析純AR）；水合氯醛（上海試劑公司，分析純AR），0.1 M PBS（NaCl 9g+NaH2PO4·2H2O 2.964g+Na2HPO4·12H2O 29.01g+蒸餾水至1000ml）；0.1%DEPC溶液（lmlDEPC+999mlPBS）；4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2～7.6）（多聚甲醛40g+0.1%DEPC溶液至1000ml）；BDNF原位雜交試劑盒（武漢博士德公司）；莫那奇湯（老虎刺皮、黑皮跌打、山皮條、滿山香、藤蕉、大荃麻、松節(jié)、楊梅皮、天紅地綠等各9g，濃度為1200g生藥/L）。

1.3 ICH模型的制備和篩選 手術(shù)器械消毒備用，參照并改進(jìn)Rosenberg等[2]報(bào)道的方法制作ICH大鼠模型。大鼠造模完成待大鼠清醒后，采用Berderson[3]評(píng)分法，篩選成功模型動(dòng)物。根據(jù)Berderson神經(jīng)體征評(píng)分法：輕抓尾巴，提起高于桌面10cm，正常大鼠前爪伸直。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分：腦部病變對(duì)側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲，肩內(nèi)收屈曲；2分：上述體征陽(yáng)性，向麻痹側(cè)推阻力下降；3分：活動(dòng)時(shí)向麻痹側(cè)打圈（呈追尾狀）。分?jǐn)?shù)在1分以上（包括1分）即為造模成功。

1.4 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)方法 空白組：10只大鼠，不做任何手術(shù)處理，常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水1ml，每日1次，連續(xù)3d。假手術(shù)組：10只大鼠，分別用10%水合氯醛（0.4ml/100g）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，術(shù)中微量注射器沿鉆孔進(jìn)針約6mm，留針約7min，緩慢出針，處理創(chuàng)面，清醒后常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水1ml，每日1次，連續(xù)3d。模型組：10只，造模后不治療，常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水1ml，每日1次，連續(xù)3d。莫那奇組：每日按生藥4.5g/kg體重/d給予莫那奇湯灌胃，每日1次，連續(xù)3d。各組大鼠在造模3d后重新進(jìn)行Berderson神經(jīng)體征評(píng)分。

1.5 標(biāo)本采集 大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g深麻醉，順序灌注生理鹽水和4%多聚甲醛/0.1M PBS（PH7.2～7.4）各約200ml，灌注完畢后在冰浴中快速開(kāi)顱并取出完整腦，距注射針孔前后各約2mm冠狀切開(kāi)，將標(biāo)本放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.6 制作石蠟切片 固定腦組織30～40min后沖水2～3h，脫水透明（將腦組織依次浸入70%乙醇3h、80%乙醇2h、90%乙醇過(guò)夜、95%乙醇2h、無(wú)水乙醇Ⅰ0.5h、無(wú)水乙醇Ⅱ0.5h、二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min），浸蠟（將腦組織依次浸入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ各2h），包埋后切片（片厚5μm）。將切片放入60℃烤箱2h。

1.7 原位雜交檢測(cè)BDNF 石蠟切片常規(guī)脫蠟，滴加3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶，后固定，預(yù)雜交，雜交，洗滌，滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化過(guò)氧化物酶，DAB顯色，必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗，脫水，透明，封片。

1.8 圖像分析 利用病理圖像分析軟件，在400倍光鏡下，隨機(jī)選取每張切片ICH血腫周邊5個(gè)不同視野，陽(yáng)性細(xì)胞呈褐色或棕黃色，區(qū)分各切片所選視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)用x±s表示，各組間比較采用單因素方差分析 （One-Way ANOVA），方差齊時(shí)選用LSD法，方差不齊時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Berderson神經(jīng)體征評(píng)分比較 莫那奇組、模型組大鼠均表現(xiàn)不同程度的出血對(duì)側(cè)偏癱，莫那奇組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?？瞻捉M和假手術(shù)組大鼠無(wú)神經(jīng)功能異常。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠腦組織BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較 莫那奇組、模型組分別與空白組、假手術(shù)組進(jìn)行比較，BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，莫那奇組大鼠腦組織BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）?？瞻捉M和假手術(shù)組基本無(wú)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。見(jiàn)表2。

3 討論

腦出血是中老年人多發(fā)病種，起因復(fù)雜，病理機(jī)制尚不明確，并發(fā)癥和后遺癥多，其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率給病患生活帶來(lái)極大困擾，因此也是廣大醫(yī)務(wù)工作者和基礎(chǔ)科研的重點(diǎn)研究對(duì)象。

臨床上腦出血急性期多采用手術(shù)療法，如開(kāi)顱清除血腫、降顱壓、穿刺抽吸血腫、血性腦液引流等，一般療法包括吸氧、控制血壓、降溫、防治并發(fā)癥等輔助措施，但老年人由于體質(zhì)弱、耐受差、術(shù)后易感染，不宜施行手術(shù)，因此尋找安全有效的療法對(duì)中老年患者十分必要。傳統(tǒng)醫(yī)藥治療腦出血有豐富的經(jīng)驗(yàn)積累，能有效減輕出血后腦組織損傷程度，提高患者生活質(zhì)量，目前應(yīng)用較多的傳統(tǒng)方法多為中草藥制劑，如川芎嗪、羚角鉤藤湯、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯等[4]。

哈尼族醫(yī)藥作為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，已有數(shù)千年的發(fā)展歷史，其以多樣的療法和顯著的療效，有力地保障了哈尼族的文明延續(xù)，備受哈尼人民尊重。墨江縣委黨校醫(yī)務(wù)室胡氏之“莫那奇”，哈尼族用語(yǔ)，意為“中風(fēng)、風(fēng)濕麻木很好的藥”。莫那奇由哈尼族民族民間草藥為主組成：老虎刺皮（駱銘傲割阿孜）、黑皮跌打（啊納呃積赤）、山皮條（呃殼呃積）、滿山香（約茅膩）、藤蕉（札柯倍都耶）、大荃麻（和茄榪）、松節(jié)（托自阿尼）、楊梅皮（昔切呃積）、天紅地綠（咪呢秘尼）等（括號(hào)內(nèi)藥名為哈尼用語(yǔ)）。主要功效為活血化瘀、行氣止痛、通經(jīng)活絡(luò)。其中天紅地綠、滿山香、藤焦等辛辣芳香，為健脾理氣之品，能行氣活血；黑皮跌打、楊梅皮、老虎刺皮、山皮條等有活血止血的功效。哈尼醫(yī)藥與中醫(yī)藥理論有許多相通和相似之處，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其研究提供了很好的契機(jī)。研究表明，腦出血后腦內(nèi)瘀血、水腫、血紅蛋白毒性、繼發(fā)性腦缺血等多種因素致使胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路激活，氧自由基增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。BDNF是最重要的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[5]，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中，有促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、保護(hù)和修復(fù)損傷的作用[6-7]。生理狀態(tài)下BDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較少，ICH出血灶周圍組織中BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，BDNF表達(dá)上升，其受體TrkB與BDNF表達(dá)協(xié)同上調(diào)，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BDNF通過(guò)激活其受體TrkB，阻斷胞內(nèi)損傷因子對(duì)蛋白激酶C的失活，來(lái)防止神經(jīng)元發(fā)生變性、死亡[8]。石秋艷等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ICH后誘導(dǎo)BDNF蛋白表達(dá)，有利于對(duì)損傷NCs的保護(hù)和修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中，莫那奇湯組與對(duì)照組相比，大鼠神經(jīng)缺損體征有一定程度的恢復(fù)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腦出血病灶周圍組織中BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加顯著，由此推斷，莫那奇湯促進(jìn)腦組織BDNF的表達(dá)，有利于損傷神經(jīng)元的保護(hù)和修復(fù)，可能是其治療腦出血的機(jī)制之一。

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（收稿日期：2015.10.12）