冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性及膜電位的影響

傅大莉等

摘要：目的 研究冰片對(duì)皮膚活性表皮作用方式，探究冰片作為經(jīng)皮促透劑的促透作用機(jī)制。方法 選擇常用經(jīng)典化學(xué)經(jīng)皮促透劑氮酮作為陽(yáng)性對(duì)照促透劑，采用CCK-8試劑盒測(cè)定并計(jì)算冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞的半數(shù)抑制率（IC50），利用熒光漂白恢復(fù)技術(shù)測(cè)定不同濃度冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位及細(xì)胞膜內(nèi)Ca2+濃度的影響。結(jié)果 冰片和氮酮的藥物IC50分別為2.826、0.172 mmol/L；冰片可增加HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性，且隨著藥物濃度的增大而增加，呈劑量依賴(lài)性關(guān)系；冰片可降低HaCaT細(xì)胞膜電位和HaCaT細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，表現(xiàn)出類(lèi)似氮酮作用特點(diǎn)。結(jié)論 冰片的經(jīng)皮促透作用機(jī)制可能與其影響角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度進(jìn)而改變活性表皮角質(zhì)形成細(xì)胞膜電位和膜流動(dòng)性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：冰片；促透劑；細(xì)胞膜流動(dòng)性；HaCaT細(xì)胞；細(xì)胞膜電位

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.018

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）04-0062-05

Effects of Borneol on Membrane Fluidity and Membrane Potential of HaCaT Cell FU Da-li1， YONG Xiao-lan1， LIU De-fang1， XIAO Shuang2 （1.General Hospital of Chengdu Military Region， Chengdu 610083， China；2.Sichuan Provincial Peoples Hospital， Chengdu 610072， China）

Abstract：Objective To investigate the action mode of borneol on activity of epidermal skin；To investigate action mode of borneol as penetration enhancer. Methods The well-established and standard penetration enhancer Azone was employed as a positive control in this study. The cytotoxicities of borneol and Azone on HaCaT cells were detected by CCK-8 assay， and their half 50% inhibitory concentrations （IC50） were calculated. The fluorescence recovery after photo bleaching was employed to investigate the effect of borneol and Azone on membrane fluidity， and the flow cytometer was used to monitor the changes of membrane potential of HaCaT cell after treated with these penetration enhancers. Results The IC50 values of borneol and Azone were 2.826 ， 0.172 mmol/L， respectively. Borneol could significantly improve the membrane fluidity in a concentration-dependent manner， and effectively decrease the membrane potential of HaCaT cell， which exhibited the performances similar to those of Azone. Conclusion The penetration enhancement mechanism of borneol was associated with the concentrations of Ca2+ in keratinocytes， which changes the membrane fluidity and membrane potential of HaCaT cell.

Key words：borneol；penetration enhancer；membrane fluidity；HaCaT cell；membrane potential

基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)生廳科研課題（120573）

的影響[J].放射免疫學(xué)雜志，2010，23（3）：282-283.

[5] 趙海梅，劉端勇，湯菲，等.四神丸對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜修復(fù)的保護(hù)機(jī)制研究[J].中成藥，2009，31（12）：1935-1937.

[6] 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：1088.

[7] 甘華田，歐陽(yáng)欽，賈道全，等.潰瘍性結(jié)腸炎患者核因子-κB活化與細(xì)胞因子基因表達(dá)[J].中華內(nèi)科雜志，2002，41（4）：252-255.

[8] 張志軍，王磊，蔣曉云，等.TLR4mAb對(duì)急性期潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影響[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)，2008， 35（2）：176-179.

[9] Abreu MT， Arnold ET， Thomas LS. TLR4 and MD-2 expression is regulated by immune-mediated signals in human intestinal epithelial cells[J]. The Journal of Biological Chemistry，2002， 277（23）：20431-20437.

（收稿日期：2014-08-17）

（修回日期：2014-08-26；編輯：華強(qiáng)）

冰片屬開(kāi)竅藥，具有辛香走竄之性，能引藥由肌表直達(dá)腠理，在中藥外用制劑中應(yīng)用廣泛，從而促進(jìn)中藥外用制劑中有效成分透皮吸收，表現(xiàn)出類(lèi)似現(xiàn)代經(jīng)皮制劑中的促透劑作用[1-2]。皮膚表皮作為藥物經(jīng)皮吸收的重要屏障，主要由角質(zhì)層和活性表皮組成，關(guān)于冰片促透作用機(jī)制，有研究考察冰片對(duì)表皮角質(zhì)層的影響[3-4]，但尚未闡明其對(duì)皮膚活性表皮的作用，目前也缺乏經(jīng)皮促透劑對(duì)皮膚活性表皮的促透作用機(jī)制研究。因此，本研究采用HaCaT細(xì)胞模型，測(cè)定冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜電位的影響，研究其對(duì)皮膚活性表皮的影響，為進(jìn)一步闡明冰片促進(jìn)藥物透皮吸收的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

冰片，北京本草方源藥業(yè)有限公司，批號(hào)20140422；胎牛血清，賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，批號(hào)NXF0650；青鏈霉素混合液，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20130318；MEM/EBSS，賽黙飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，批號(hào)NYC0831；胰蛋白酶-EDTA消化液，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20130313；氮酮，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20110831；磷酸鹽緩沖液（PBS），北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20130531；Invitrogen Incorporation，批號(hào)1313498；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8）， Dojindo，批號(hào)EJ744；Fluo3-AM，Dojindo，批號(hào)EX767；DiBAC4（3）熒光探針。

1.2 儀器

Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司），F(xiàn)V1000激光共聚焦掃描顯微鏡（日本奧林巴斯公司），BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國(guó)DB公司）。

1.3 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。將HaCaT細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素混合液的MEM/EBSS培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法測(cè)定冰片HaCaT細(xì)胞毒性

收集對(duì)數(shù)期HaCaT細(xì)胞，以每孔7.0×103的細(xì)胞密度接種于96孔板，并設(shè)置空白組（PBS）、對(duì)照組（含0.5%DMSO培養(yǎng)基）及系列藥物組，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入系列不同濃度冰片及陽(yáng)性對(duì)照藥氮酮。藥物作用24 h后移去培養(yǎng)基，加入1 mL含10 μL CCK-8試液培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h。于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞存活率[（A藥物組-A空白組）÷（A對(duì)照組-A空白組）×100%]。根據(jù)系列不同濃度藥物細(xì)胞存活率及文獻(xiàn)方法，計(jì)算藥物半數(shù)抑制率（IC50）[5]。

1.5 細(xì)胞膜流動(dòng)性的測(cè)定

利用激光共聚焦顯微鏡的熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（FRAP）觀察并測(cè)定藥物作用HaCaT細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響。以每孔15×104的細(xì)胞密度接種于激光共聚焦培養(yǎng)小皿，并設(shè)置空白組（正常培養(yǎng)基）、對(duì)照組（含0.5%DMSO培養(yǎng)基）及高、中、低濃度冰片和氮酮藥物組。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，移去培養(yǎng)基，并用PBS小心清洗3遍，每孔加入0.5 mL 2 μL/mL NBD-C6-HPC熒光探針溶液培養(yǎng)0.5 h，然后再用PBS小心清洗3遍，置于激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行測(cè)定。儀器參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，接收波長(zhǎng)530 nm，熒光漂白的激光功率100%，漂白時(shí)間900 ms，掃描頻率1.65 s，總掃描時(shí)間為120 s。記錄熒光漂白位置熒光漂白動(dòng)畫(huà)，細(xì)胞膜流動(dòng)性以熒光恢復(fù)率進(jìn)行表征。熒光恢復(fù)率（%）=（F2-F1）÷（F1-F0）×100%。式中，F(xiàn)2為熒光漂白后的熒光值，F(xiàn)1為熒光漂白前的熒光值。F0為漂白后即刻熒光值熒光恢復(fù)率越大，細(xì)胞膜流動(dòng)性越大。

1.6 細(xì)胞膜電位的測(cè)定

采用流式細(xì)胞儀測(cè)定冰片及陽(yáng)性藥氮酮對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位的影響。將HaCaT細(xì)胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，設(shè)置空白組（正常培養(yǎng)基）、對(duì)照組（含0.5% DMSO培養(yǎng)基）及高、中、低濃度冰片和氮酮藥物組，待細(xì)胞貼壁后12 h分別加入對(duì)應(yīng)藥物，置CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。用胰蛋白酶消化、離心，去除上清液后加入500 μL DiBAC4（3）熒光探針溶液（5 μg/mL），37 ℃孵育0.5 h，離心后棄上清液，用0.5 mL PBS分散后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞膜電位測(cè)定。儀器參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，接收波長(zhǎng) 530 nm，用未經(jīng)熒光物質(zhì)孵育HaCaT細(xì)胞調(diào)零。

1.7 HaCaT細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的測(cè)定

將HaCaT細(xì)胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并設(shè)置空白組（正常培養(yǎng)基）、對(duì)照組（含0.5% DMSO培養(yǎng)基）、及高、中、低濃度冰片和氮酮藥物組，待細(xì)胞貼壁后分別加入對(duì)應(yīng)的藥物培養(yǎng)24 h。然后用胰蛋白酶消化，D-Hanks溶液稀釋并調(diào)整細(xì)胞密度為70×104/孔，離心去上清液，加入0.5 mL Fluo 3-AM （5 μmol），置培養(yǎng)箱孵育0.5 h后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定HaCaT細(xì)胞熒光強(qiáng)度。儀器參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，接收波長(zhǎng)520 nm。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

冰片和氮酮對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響大致呈濃度依賴(lài)性關(guān)系，根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算冰片和氮酮IC50，分別為（2.826±0.261）、（0.172±0.003）mmol/L，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，相對(duì)于常用化學(xué)經(jīng)皮促透劑氮酮，冰片具有較低的細(xì)胞毒性，提示冰片作為經(jīng)皮促透劑可能具有較低的皮膚刺激性。其中，當(dāng)冰片和氮酮濃度分別低于0.312、0.039 mmol/L時(shí)，對(duì)HaCaT細(xì)胞活性影響較低，因此，選擇0.300、0.200、0.100 mmol/L冰片及0.050、0.025、0.001 mmol/L氮酮分別作為高、中、低濃度考察其對(duì)HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜電位的影響。

2.2 冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

采用熒光探針作用后激光共聚焦的熒光圖像，測(cè)定HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性之前先在細(xì)胞上選定熒光漂白部位（小圈），熒光漂白前可見(jiàn)HaCaT細(xì)胞膜熒光呈綠色且分布較為均勻，在利用激光漂白瞬間漂白部位的綠色熒光消失，然后由于細(xì)胞膜存在流動(dòng)性，漂白周?chē)臒晒怆S著細(xì)胞膜的流動(dòng)性轉(zhuǎn)移到漂白區(qū)域，一段時(shí)間后，漂白部位熒光會(huì)有一定程度的恢復(fù)（見(jiàn)圖2）。同時(shí)，在漂白前到熒光恢復(fù)前記錄漂白區(qū)域內(nèi)熒光強(qiáng)度值并得出熒光恢復(fù)曲線(xiàn)（見(jiàn)圖3）。然后，根據(jù)漂白區(qū)域內(nèi)熒光漂白前后的熒光強(qiáng)度值計(jì)算細(xì)胞膜熒光恢復(fù)率，從而測(cè)定細(xì)胞膜流動(dòng)性的大小。

由表1所知，正常HaCaT細(xì)胞膜的熒光恢復(fù)率為42.3%，以0.5%DMSO為溶劑的對(duì)照組的熒光恢復(fù)率為44.6%，說(shuō)明采用0.5%DMSO作為冰片和氮酮溶劑對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性沒(méi)有顯著影響。在不同濃度氮酮作用下，細(xì)胞膜流動(dòng)性均顯著增加（P<0.05），且隨氮酮應(yīng)用濃度增加表現(xiàn)出細(xì)胞膜流動(dòng)性增加作用。而在冰片作用下，HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性增加，且呈濃度依賴(lài)性，隨濃度增加而加強(qiáng)，表現(xiàn)出與化學(xué)促透劑氮酮相似的作用特點(diǎn)，表明冰片可增加HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性。

2.3 冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位的影響

HaCaT細(xì)胞靜息狀態(tài)下，細(xì)胞膜內(nèi)呈負(fù)電荷，膜外帶正電，從而在HaCaT細(xì)胞膜內(nèi)外形成一定電勢(shì)差，熒光探針可在此電勢(shì)差作用下進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)細(xì)胞膜內(nèi)外電勢(shì)差變?nèi)鯐r(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)熒光物質(zhì)相應(yīng)減少，因此，可根據(jù)熒光探針熒光強(qiáng)度值判斷相應(yīng)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜電位的影響。值得注意的是，DiBAC4（3）為帶負(fù)電荷探針，利用該熒光探針檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度值越大，表明細(xì)胞膜表面電位越低[7]。

圖4為冰片高濃度組作用下流式細(xì)胞儀測(cè)定的HaCaT細(xì)胞膜電位代表圖譜，由表2可知，空白組與對(duì)照組熒光強(qiáng)度值未表現(xiàn)出明顯差異（P>0.05），說(shuō)明0.5%DMSO作為冰片和氮酮溶劑對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位沒(méi)有顯著影響。而在中、高濃度氮酮作用下，所檢測(cè)的HaCaT細(xì)胞熒光值顯著增加，說(shuō)明該濃度氮酮作用下HaCaT細(xì)胞膜電位降低，而低濃度氮酮未對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位產(chǎn)生影響。同樣，根據(jù)高、中、低濃度冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞膜熒光值可知，低濃度冰片也未對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位產(chǎn)生顯著影響，但隨著冰片濃度增加，HaCaT細(xì)胞膜電位顯著降低，表現(xiàn)出類(lèi)似氮酮的作用方式，提示冰片具有降低HaCaT細(xì)胞膜電位作用。

2.4 冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

分別給予高、中、低濃度冰片（3個(gè)濃度值的設(shè)置同細(xì)胞膜電位和流動(dòng)性試驗(yàn)），熒光強(qiáng)度值的變化反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，從而測(cè)定冰片對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。圖5為冰片低濃度組作用下流式細(xì)胞儀測(cè)定的HaCaT細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的代表圖譜?？瞻捉M與對(duì)照組熒光強(qiáng)度值未表現(xiàn)出顯著差異（P>0.05），說(shuō)明0.5%DMSO作為冰片和氮酮溶劑對(duì)細(xì)胞Ca2+濃度沒(méi)有顯著影響。由表3可知，高、中、低濃度氮酮作用下，HaCaT細(xì)胞Ca2+熒光強(qiáng)度值均顯著降低，提示氮酮可降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，而低濃度冰片對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度未產(chǎn)生顯著影響，但隨著冰片濃度值的增加，熒光強(qiáng)度值降低，表現(xiàn)出類(lèi)似氮酮的作用特點(diǎn)，說(shuō)明冰片可降低HaCaT細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

3 討論

皮膚主要由表皮、真皮和皮下組織組成，由于真皮層上部存在豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，藥物通透到達(dá)真皮后就很快被吸收，因此，皮膚表皮是藥物經(jīng)皮吸收的主要通透屏障。皮膚表皮由外向內(nèi)可分為5層，即角質(zhì)層、透明層、粒層、棘層和基層，其中，除已角化的角質(zhì)層外，其他各層統(tǒng)稱(chēng)為活性表皮。表皮實(shí)際上包含兩類(lèi)細(xì)胞，即角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，約占95%）和非角質(zhì)形成細(xì)胞（包括黑素細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞以及梅克爾細(xì)胞等）。而HaCaT細(xì)胞作為一種重要的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，目前已成為外用透皮用藥研究的一種重要模型[6]。因此，本研究采用HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞模型研究冰片對(duì)皮膚活性表皮的影響。此外，氮酮作為經(jīng)典的常用化學(xué)經(jīng)皮促透劑，已在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)中作為皮膚滲透促進(jìn)劑得到廣泛應(yīng)用，也是經(jīng)皮促透劑促透效果評(píng)價(jià)的常用參照促透劑[7]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇氮酮對(duì)比研究冰片對(duì)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞作用特點(diǎn)。

細(xì)胞膜內(nèi)的脂質(zhì)和蛋白分子具有一定流動(dòng)性，細(xì)胞膜流動(dòng)性的改變常伴隨著許多細(xì)胞功能的變化，如物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、膜結(jié)合酶活性、配體與膜受體的結(jié)合、細(xì)胞的分化與細(xì)胞識(shí)別等方面[8]。相關(guān)研究也表明，一些經(jīng)皮促透劑可通過(guò)影響皮膚表皮角質(zhì)細(xì)胞膜流動(dòng)性，從而增強(qiáng)皮膚表皮細(xì)胞間流動(dòng)性，利于藥物的透皮轉(zhuǎn)運(yùn)吸收[6]。本研究結(jié)果提示，冰片具有增加角質(zhì)形成細(xì)胞膜流動(dòng)性作用，表現(xiàn)出與化學(xué)促透劑相似的作用特點(diǎn)，提示冰片可通過(guò)增加皮膚表皮細(xì)胞間流動(dòng)性，從而降低藥物通透皮膚表皮的屏障作用。

細(xì)胞膜電位也是細(xì)胞膜最重要的生物物理學(xué)特征之一，其形成與細(xì)胞膜上各種離子泵的存在有關(guān)，在細(xì)胞膜內(nèi)外有一定的離子濃度差，從而形成電勢(shì)差。細(xì)胞膜電位的改變常伴隨著相關(guān)細(xì)胞膜脂功能和結(jié)構(gòu)的改變，如膜黏度、膜厚度、離子滲透等[9-10]。Hamman等[11]研究報(bào)告指出，皮膚表皮類(lèi)似于上皮組織細(xì)胞，在細(xì)胞的緊密連接處存在一定負(fù)電荷。而一些經(jīng)皮促透劑可與這些負(fù)電荷產(chǎn)生一定相互作用，是其促進(jìn)藥物向透皮吸收或向皮膚深層轉(zhuǎn)動(dòng)的作用機(jī)制之一[6，12]。本研究結(jié)果顯示，冰片也具有降低表皮角質(zhì)形成細(xì)胞膜電位作用，可能通過(guò)影響皮膚表面負(fù)電荷而改變皮膚活性表皮屏障作用，有利于藥物透過(guò)皮膚活性表皮層。

Ca2+作為細(xì)胞最古老、作用最廣泛的細(xì)胞信使之一，在人皮膚角質(zhì)細(xì)胞增殖、分化等生理生化反應(yīng)中均具有重要的調(diào)節(jié)作用[13]，而細(xì)胞內(nèi)外Ca2+平衡被打破，將會(huì)改變角質(zhì)細(xì)胞的膜流動(dòng)性及其緊密連接程度、膜電位等[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冰片及氮酮作用下，HaCaT細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度都顯著降低，提示冰片增加表皮角質(zhì)形成細(xì)胞膜流動(dòng)性、降低細(xì)胞膜電位，可能與其對(duì)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+平衡影響有關(guān)，但相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，冰片作為天然的經(jīng)皮促透劑不僅可影響表皮最外層角質(zhì)層的屏障作用，還可影響角質(zhì)形成細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜電位等降低皮膚活性表皮屏障功能，從而有利于藥物的經(jīng)皮吸收。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用HaCaT細(xì)胞作為促透劑促滲機(jī)制研究模型，考察冰片對(duì)其細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜電位的影響，探索冰片促進(jìn)藥物透皮吸收的相關(guān)作用機(jī)制，也為深入闡明經(jīng)皮促透劑作用機(jī)制的研究提供新的思路和方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 袁志曌，邢建峰，黃新亮，等.冰片對(duì)白斑霜中氟尿嘧啶和地塞米松體外透皮作用的研究[J].中藥材，2009，32（8）：1295-1297.

[2] 王曉穎，葉夢(mèng)屏.3種促透劑對(duì)鉤藤體外透皮吸收的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27（7）：623-625.

[3] 孫靜靜，陳俊紅，方光遠(yuǎn)，等.冰片作為涂膜劑促透劑對(duì)小鼠經(jīng)皮給藥后皮膚上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察[J].畜牧與獸醫(yī)，2014，46（5）：77-78.

[4] 宇克莉，孫建華.幾種透皮吸收促進(jìn)劑的作用機(jī)理探討[J].山東醫(yī)藥， 2007，47（11）：30-31.

[5] Xiang W， Gao A， Liang H， et al. Reversal of P-glycoprotein- mediated multidrug resistance in vitro by milbemycin compounds in adriamycin-resistant human breast carcinoma （Mcf-7/Adr） cells[J]. Toxicology in Vitro，2010，24（6）：1474-1481.

[6] He W， Guo X， Xiao L， et al. Study on the mechanisms of chitosan and its derivatives used as transdermal penetration enhancers[J]. International Journal of Pharmaceutics，2009，382（1/2）：234-243.

[7] Batheja P， Sheihet L， Kohn J， et al. Topical drug delivery by a polymeric nanosphere gel：formulation optimization and in vitro and in vivo skin distribution studies[J]. Journal of Controlled Release，2011，149（2）：159-167.

[8] 糜漫天，朱錫華.膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對(duì)淋巴細(xì)胞跨膜膜電位的影響[J].免疫學(xué)雜志，1996，12（3）：172-176.

[9] Zbytovská J， Raudenkolb S， Wartewig S， et al. Phase behaviour of transkarbam 12[J]. Chemistry and Physics of Lipids，2004， 129（1）：97-109.

[10] Thanou M， Verhoef J， Junginger H. Oral drug absorption enhancement by chitosan and its derivatives[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2001，52（2）：117-126.

[11] Hamman JH， Stander M， Kotzé AF. Effect of the degree of quaternisation of N-trimethyl chitosan chloride on absorption enhancement：in vivo evaluation in rat nasal epithelia[J]. International Journal of Pharmaceutics，2002，232（1/2）：235-242.

[12] Taveira SF， Nomizo A， Lopez RF. Effect of the iontophoresis of a chitosan gel on doxorubicin skin penetration and cytotoxicity[J]. Journal of Controlled Release，2009，134（1）：35-40.

[13] 孫強(qiáng)，柴家科，梁黎明，等.Ca2+對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與分化調(diào)控的作用研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2007，16（9）：1181-1184.

[14] 梁慶.薄荷醇的促透作用及其機(jī)制研究[D].廣州：廣東藥學(xué)院，2009.

（收稿日期：2014-09-16；編輯：華強(qiáng)）