強直性脊柱炎患者血清Dkk—1水平與骨影像學變化的相關分析

謝建民 趙成

【摘 要】目的：探討強直性脊柱炎患者血清Dickkopf-1（Dkk-1）的水平及其診斷價值，了解Dkk-1與強直性脊柱炎炎癥及放射學進展的關系。方法：選取接受注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（益賽普）治療的強直性脊柱炎患者55例為強直性脊柱炎組，同期45例健康體檢者作為對照組。隨訪2年，分別在基線狀態(tài)、治療24個月時評估強直性脊柱炎患者各項臨床指標[年齡、性別、疾病活動度（BASFI、BASDAI、BASMI、BASRI）]、影像學進展（mSASSS）以及炎癥指標[紅細胞沉降率（ESR）、C-反應蛋白（CRP）]。采用ELISA法檢測強直性脊柱炎患者血清Dkk-1濃度。運用相關分析法分析Dkk-1與疾病活動度、影像學進展及炎癥指標的關系。結果：強直性脊柱炎組在基線狀態(tài)時，ESR及血清CRP水平高于對照組，但Dkk-1濃度（72.6±19.5）pg·mL-1低于對照組（98.0±27.6）pg·mL-1（P < 0.01）；強直性脊柱炎組在治療24個月時，ESR及血清CRP水平較基線狀態(tài)時明顯下降（P < 0.01），治療24個月時，BASFI、BASMI和BASDI評分較基線狀態(tài)時明顯改善（P < 0.01），但在治療24個月時，Dkk-1濃度為（74.2±15.3）pg·mL-1，較基線狀態(tài)時稍有升高（P = 0.57），仍低于對照組（98.0±27.6） pg·mL-1（P < 0.01）。ROC曲線分析顯示，Dkk-1水平69.75 pg·mL-1為截斷點，該點診斷的敏感度為84.02%，特異度為91.50%，曲線下面積（AUC）為0.94，診斷效力高。相關分析顯示，強直性脊柱炎組患者在基線狀態(tài)時和治療24個月時，血清Dkk-1水平與ESR、CRP、BASFI、BASMI以及BASDAI評分無明顯相關性。而放射學指數BASRI及影像學mSASSS評分在基線狀態(tài)和治療后差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.01），且mSASSS評分與Dkk-1水平在基線狀態(tài)和治療24個月時呈顯著負相關（r = -0.78，P < 0.01）。結論：腫瘤壞死因子拮抗劑對強直性脊柱炎患者血清Dkk-1水平無明顯改善，血清Dkk-1水平與放射學變化明顯相關，提示血清Dkk-1的產生可能與炎癥狀態(tài)無明顯相關性，Dkk-1可能參與了強直性脊柱炎的骨化形成；腫瘤壞死因子拮抗劑可能對強直性脊柱炎骨化進程無明顯阻止作用，強直性脊柱炎患者血清Dkk-1可作為一種新的反映骨化指標及影像學進展的血清生物標志物。

【關鍵詞】 脊柱炎，強直性；血清；Dkk-1；骨化；影像學；疾病活動度；炎癥指標；益賽普

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.05.003

【ABSTRACT】Objective：To investigate the serum Dkk-1 level and its diagnostic value in patients with ankylosing spondylitis to learn the relationship between Dkk-1 and bone imaging changes.Methods：Chose 55 cases of ankylosing spondylitis treated with Yisaipu （Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-α ReceptorⅡ：Igg Fc Fusion Protein） as the ankylosing spondylitis group，and 45 healthy subjects as the control group.During the 2 years of follow-up，evaluated，respectively at baseline and after 24 months of treatment，the clinical index （age，gender，disease activity：BASFI，BASDAI，BASMI，BASRI），radiographic progression （mSASSS） and inflammatory index （ESR，CRP） of the patients with ankylosing spondylitis.ELISA method was used to detect serum Dkk-1 concentration of ankylosing spondylitis patients.Relative analysis Methods were used to analyze the relationship between Dkk-1 and disease activity，radiographic progression and inflammatory biomarkers.Results：ESR and serum CRP levels of the ankylosing spondylitis group were higher than those of the control group at the baseline，but the concentration of Dkk-1（72.6±19.5） pg·mL-1 was lower than that of the control group （98.0±27.6） pg·mL-1（P < 0.01）.At the 24 th month of treatment，ESR and serum CRP level of the ankylosing spondylitis group significantly decreased （P < 0.01）than those of at the baseline，while BASFI，BASMI and BASDI were significantly improved（P < 0.01） compared with those at the baseline.After 24 months of treatment，the concentration of Dkk-1 （74.2±15.3）pg·mL-1 was slightly increased（P = 0.57） compared with that at the baseline，but still lower than the control group （98.0 ± 27.6）pg·mL-1（P < 0.01）.ROC curve analysis showed that the level of Dkk-1（69.75 pg·mL-1） was the cut-off point，whose diagnostic sensitivity was 84.02%，specificity was 91.50%，and area under curve （AUC） was 0.94，with high efficiency of diagnosis.Correlation analysis showed that at the baseline and after 24 months of treatment，there was no significant correlation between the serum level of Dkk-1 and ESR，CRP，BASFI，BASMI and BASDAI.The BASRI and mSASSS score had no significant differences at the baseline and after treatment（P > 0.05），and there was a significant negative correlation（r = -0.78，P < 0.01） between the scores of mSASSS and the Dkk-1 levels at the baseline and after 24 months of treatment.Conclusion：Tumor necrosis factor antagonist cannot significantly improve serum Dkk-1 level in patients with ankylosing spondylitis，and the level of serum Dkk-1 correlates with the radiographic changes，suggesting that the generation of serum Dkk-1 has no significant correlation with the inflammatory state，and Dkk-1 may be involved in ankylosing spondylitis ossification.Tumor necrosis factor antagonist may have no obvious preventive effect on the ossification process，and serum Dkk-1 in patients with ankylosing spondylitis can be regarded as a biomarker to reflect the ossification indexes and iconographical progress.

【Keywords】 spondylitis，ankylosing；serum；Dkk-1；ossification；iconography；disease activity degree；inflammation index；Yisaipu

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種以附著點炎及韌帶骨贅形成為主要病理特征的慢性進展性炎性疾病[1-2]。韌帶骨贅生成是AS患者影像學結構破壞的標志性特征，也是影響患者機體功能和脊柱活動度的主要因素，最終可導致進展性脊柱強直及活動受限。目前，骨贅形成的機制尚不清楚。新近研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在骨形成方面起重要作用，可能參與了AS韌帶骨贅的形成[3]。

Dickkopf-1（Dkk-1）是Wnt信號的天然阻斷因子，對Wnt介導的骨重塑過程起關鍵的調節(jié)作用，Dkk-1可直接干擾Wnt/β-catenin通路的信號轉導過程，抑制Wnt介導的成骨作用，從而使骨形成減少[4-5]。目前，Dkk-1是否影響韌帶骨贅的形成及其在AS發(fā)病機制中的意義尚不明確。韌帶骨贅形成及椎體骨性強直是AS的特征性表現(xiàn)，傳統(tǒng)的X線檢查被認為是定量評價AS患者脊柱結構變化的金標準。新近研究認為，修訂版斯托克脊柱評分（mSASSS）是目前評價AS脊柱骨化進展最有效、可靠、敏感的影像學指標[6-7]，且與AS患者的活動功能相關，故本研究采用mSASSS評價患者的影像學進展。為此，本研究觀察AS患者血清Dkk-1水平在腫瘤壞死因子（TNF）拮抗劑治療前后與AS相關的臨床指標BASDAI、BASFI、BASMI、BASRI、mSASSS，及血清中炎癥指標如紅細胞沉降率（ESR）、C-反應蛋白（CRP）水平等的關系，以期為AS的治療及詮釋骨贅形成機制提供新的思路。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2012年5月至2014年12月本院風濕科收治的55例AS患者為AS組，同期健康體檢者45例為對照組（無心血管疾病、肝腎疾病、風濕性疾病、炎癥及感染）。所有AS患者給予24個月的注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（益賽普，上海中信國建藥業(yè)股份有限公司，國藥準字S20050058）每次25 mg，每周2次，皮下注射治療，由風濕?？漆t(yī)師指導用藥及決定療程。

1.2 納入標準 AS患者均符合1984年修訂的紐約診斷標準，盡量避免因病情活動造成的選擇偏倚。

1.3 排除標準 ①合并心血管疾病、感染和其他風濕性疾病者；②不能提供研究所涉及的各項臨床資料及檢測結果者。

2 方 法

2.1 血清保存及檢測 抽取AS組患者及對照組的靜脈血，置于真空非抗凝管，30 min內迅速保存于-20 ℃，并在1個月內通過離心獲取上層血清后轉移到-80 ℃長期保存。血清Dkk-1濃度檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），試劑盒購自美國ADL公司。嚴格按照試劑盒說明操作，酶標儀測定吸光度（A），測定波長為450 nm。

2.2 影像學進展評價 分別由2位有5年影像診斷工作經驗者根據mSASSS在基線狀態(tài)和治療

24個月時進行盲法評分。mSASSS由腰椎評分和頸椎評分組成，總分0～72分。①腰椎評分：包括12胸椎、5個腰椎、骶椎上段。側位片。0分，正常；1分，侵蝕、硬化或方形變；2分，韌帶骨贅；3分，全椎體骨橋形成，竹節(jié)樣脊柱。所有病變點評分取平均值，乘以12為總分（0～36分）。②頸椎評分：第2頸椎下段至第1胸椎上緣，第3頸椎由于其生理性凹面較小，方形變不評分，其余病變評分。評分方法與腰椎相似，總分為0～36分。③骶髂關節(jié)平片：根據1984年修訂的紐約標準X線表現(xiàn)分級。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布且方差齊的計量資料以表示，組間比較采用成組設計t檢驗或秩和檢驗；計數資料組間比較采用r檢驗；相關分析采用Spearman檢驗；將血清Dkk-1與mSASSS評分進行受試者工作特征（ROC）曲線分析，評價其對診斷冠脈鈣化的敏感度和特異度。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 AS組在基線狀態(tài)時與對照組臨床和實驗室資料比較 AS組年齡、性別、BMI指標與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），ESR及CRP水平明顯高于對照組，而血清學Dkk-1水平明顯低于對照組（P < 0.01）。見表1。

3.2 AS組在TNF拮抗劑治療24個月時與基線狀態(tài)時各臨床指標比較 AS組共54例患者完成24個月治療，54例患者治療24個月時，ESR、CRP、BASDAI、BASFI、BASMI指標均比基線狀態(tài)時明顯改善，但Dkk-1濃度較基線狀態(tài)時稍有升高（P = 0.57），仍低于對照組（P < 0.01）。而放射學指數BASRI及影像學mSASSS評分在基線狀態(tài)和治療24個月時比較，差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.15，0.21，0.69）。見表2。

3.3 用ROC曲線確定血清Dkk-1的最佳臨界點 在ROC曲線下，mSASSS評分骨化的最佳血清Dkk-1的界值為69.75（曲線下面積為0.86，95%CI = [0.78，0.86]，對應的敏感度為84.02%，特異度為91.50%。見圖1。

3.4 AS患者血清Dkk-1水平與各指標的相關性 Spearman相關分析顯示，AS患者血清Dkk-1水平與ESR、CRP、BASDAI、BASFI均無明顯相關性（P > 0.05）。但與影像學mSASSS評分呈明顯負相關（r = -0.808，P < 0.01）。當mSASSS < 10時，二者無明顯相關性（r = -0.093，P = 0.63）；當mSASSS > 10時，二者呈明顯負相關（r = -0.78，P < 0.01），見圖2、圖3。

4 討 論

Dkk-1于1998年首次在兩棲動物非洲蟾蜍胚胎細胞中被發(fā)現(xiàn)，編碼為Dkk-1，是一種強大的Wnt信號通道的拮抗劑，隨后的研究證實，人類的Dkk-1基因位于10號染色體10q11上。Dkk家族共有4種：Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3和Dkk-4，除了DKK-3外，其余均為Wnt/β-catenin阻斷劑，其中Dkk-1的作用最強。既往研究發(fā)現(xiàn)，Dkk-1通過與Wnt信號轉導途徑相應的受體結合來調控細胞的分化、增殖、遷移或癌變等特性，在腫瘤發(fā)生方面發(fā)揮重要作用。目前，Uderhardt等[13]利用小鼠類風濕關節(jié)炎模型研究發(fā)現(xiàn)，以Dkk-1的特異性抗體中和小鼠關節(jié)內的Dkk-l后小鼠血清中的骨保護素顯著增加，關節(jié)局部破骨細胞數明顯減少，骨吸收被抑制。用Dkk-l反義寡核苷酸治療可抑制破骨細胞分化刺激因子的表達和破骨細胞的分化。這些研究提示，Dkk-l是體內骨平衡的負向調節(jié)者，推測抑制Dkk-1可能為治療骨量丟失提供了新的思路。

新近研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路可能參與了AS患者韌帶骨贅的形成[3，14]。Dkk-1是Wnt信號的阻斷因子，干擾其與Wnt蛋白結合而阻斷該通路，從而使骨形成減少。然而，Dkk-1是否參與了AS骨贅形成目前還不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，AS患者血清Dkk-1水平明顯低于對照組[15]，而且骨贅形成組Dkk-1水平低于無骨贅形成組，而類風濕關節(jié)炎患者Dkk-1水平明顯高于對照組，其與骨細胞死亡無明顯相關性[16-17]。本研究也證實了AS組患者血清Dkk-1水平明顯低于對照組，還發(fā)現(xiàn)血清Dkk-1水平與炎癥指標ESR、CRP、BASDI、BASFI無明顯相關性。為進一步探討TNF與Dkk-1之間的關系，筆者對入組的AS患者進行24個月的TNF拮抗劑治療，觀察治療前后血清Dkk-1的變化，結果發(fā)現(xiàn)，AS組患者血清Dkk-1水平略有升高，和治療后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），這些結果提示血清Dkk-1水平的產生與炎癥無明顯相關性，其產生可能存在其他機制。既然Dkk-1與AS的炎癥沒有相關性，那么它是否可以作為診斷AS的血清學指標？為此，采用ROC曲線分析方法確定Dkk-1水平在AS診斷的價值，結果發(fā)現(xiàn)，曲線下面積為0.94，說明診斷準確性中等，曲線下面積與AUC = 0.5比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），說明Dkk-1在AS骨化患者中有診斷價值。

影響AS骨化形成的因素非常復雜，正確估計AS骨化程度對患者診斷、預后及治療起著重要指導作用[18]。目前臨床上對AS骨化的評估主要依賴影像學表現(xiàn)。影像學mSASSS評分系統(tǒng)被認為是目前評價AS韌帶骨化最敏感有效的影像學指標，mSASSS評分的高低與AS患者的韌帶骨化程度具有良好相關性，能較準確地反映AS的骨化程度?；谝陨吓R床研究，本研究檢測了AS組患者Dkk-1水平，并觀察了其與放射學評分之間的相關性，結果表明，隨著mSASSS評分的增加，血清Dkk-1水平呈下降趨勢，二者具有明顯的負相關性。24個月TNF拮抗劑治療后，mSASSS積分與治療前差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），這些結果都提示了TNF拮抗劑可能對AS骨化進程無明顯阻止作用；而血清Dkk-1水平可作為反映AS脊柱骨化的指標，尤其是在AS病程后期。

總之，本研究結果提示，AS患者血清Dkk-1水平可作為一種新的反映骨化進展的生物學標志物，可能是預測骨化的獨立危險因素之一。Dkk-1的發(fā)現(xiàn)為研究開發(fā)抑制AS骨贅形成的藥物提供了新的思路；通過上調Dkk-1基因的表達來抑制骨化的形成，將成為治療AS韌帶骨化的新手段。隨著對Dkk-1研究的進一步深入，通過阻斷Dkk-1實現(xiàn)組織工程骨誘導的研究也必將取得新的突破，一種新的更有效的治療骨化疾病的方法也將誕生。

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收稿日期：2015-03-25；修回日期：2015-04-24