溫陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞凋亡率及RANK蛋白的影響

邱慈鑫 陳澤榮 陳晨 楊樹(shù)華 李楠 王和鳴

【摘 要】目的：探討溫陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞凋亡率及RANK蛋白的影響。方法：體外誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞系RAW264.7向破骨細(xì)胞分化，分別用溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低、中、高劑量含藥血清和生理鹽水血清干預(yù)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡率，Western Blot檢測(cè)各組RANK蛋白水平。結(jié)果：與空白對(duì)照組

比較，溫陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡（P = 0.000），降低破骨細(xì)胞RANK蛋白的表達(dá)（P = 0.000）。結(jié)論：溫陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，溫陽(yáng)補(bǔ)腎方高劑量效果最佳。

【關(guān)鍵詞】 破骨細(xì)胞；凋亡；RANK蛋白；溫陽(yáng)補(bǔ)腎方；含藥血清；激素性股骨頭壞死

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.05.002

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of serum medicated with Wenyang Bushen Formula（溫陽(yáng)補(bǔ)腎方） on osteoclast apoptosis rate and RANK protein.Methods：Differentiation in vitro was made from the osteoclast precursor cells RAW264.7 to osteoclast，which was interfered respectively with low，medium and high dose of Wenyang Bushen Formula and normal saline serum.The flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of each group，and the Western Blot was used to detect the level of RANK protein in each group.Results：Compared with the blank control group，serum medicated with Wenyang Bushen Formula could induce apoptosis of osteoclasts（P = 0.000），and reduce the expression of osteoclast RANK protein（P = 0.000）.Conclusion：Serummedicated with Wenyang Bushen Formula can induce apoptosis of osteoclasts，high dose of which is the best.

【Keywords】 osteoclasts；apoptosis；RANK protein；Wenyang Bushen Formula（溫陽(yáng)補(bǔ)腎方）；serum medicated；steroid-induced avascular necrosis of the femoral head

前期研究表明，溫陽(yáng)補(bǔ)腎方在臨床上對(duì)激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）早期療效顯著，溫陽(yáng)補(bǔ)腎中藥能通過(guò)提高SANFH兔股骨頭組織中骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)刺激成骨細(xì)胞，通過(guò)抑制RANK的表達(dá)影響破骨細(xì)胞的功能及活性[1-2]，并且溫陽(yáng)補(bǔ)腎中藥某些化學(xué)成分直接作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)其增殖[3-4]，以治療SANFH。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從溫陽(yáng)補(bǔ)腎方對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞凋亡率的影響方面加以探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)4周齡Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20） g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：2007000556492。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的相關(guān)要求。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、DMEM（Gibco公司）；TRAP染色試劑盒（GENMED公司）；細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基（RANKL）和巨噬細(xì)胞刺激集落因子（M-CSF）（R&D公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基公司）；電泳儀（BIO-RAD公司）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；倒置顯微鏡（Leica公司）。

2 方 法

2.1 溫陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清的制備 溫陽(yáng)補(bǔ)腎方組成：巴戟天15 g、骨碎補(bǔ)9 g、鹿角膠6 g、淫羊藿9 g、丹參9 g、郁金9 g、三七3 g、牛膝9 g、黃芪15 g、甘草3 g。由福建省第二人民醫(yī)院制劑室加工制成，每毫升含生藥2.5 g，高溫封瓶，4 ℃保存?zhèn)溆?。?0只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組15只。根據(jù)“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計(jì)算各組大鼠等效劑量。溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低劑量組每只灌胃4.35 g·kg-1·d-1生藥，中劑量組每只灌胃8.70 g·kg-1·d-1生藥，高劑量組每只灌胃17.40 g·kg-1·d-1生藥，空白對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。每日早、晚各1次，連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃2 h后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛[0.3 mL·（100 g）-1]腹腔麻醉后腹主動(dòng)脈采血，2000 r·min-1離心15 min，分裝過(guò)濾除菌后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定 將RAW264.7前體細(xì)胞按每孔5×104密度接種于6孔板中，加入完全培養(yǎng)液（含20 ng·mL-1 M-CSF+40 ng·mL-1 RANKL誘導(dǎo)因子及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清），37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次。每天用倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)前體細(xì)胞生長(zhǎng)及分化情況。培養(yǎng)5 d后，做破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色鑒定。按照TRAP試劑盒說(shuō)明書(shū)配置染色液，PBS沖洗待測(cè)細(xì)胞后加染色液，1組加PBS代替染色液為陰性對(duì)照組，37 ℃孵育1 h后觀察。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組破骨細(xì)胞凋亡率 將破骨細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，共接種24孔，加入各組培養(yǎng)基后培養(yǎng)48 h。將各組細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至各個(gè)BD管內(nèi)，再用PBS洗滌細(xì)胞1次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液（不含有EDTA）消化細(xì)胞。室溫孵育2 min，輕輕將貼壁破骨細(xì)胞吹打下來(lái)，防止過(guò)度消化，迅速將細(xì)胞混懸液移入有培養(yǎng)液的流式管，3000 r·min-1離心3 min后棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取3×105重懸的細(xì)胞，1000 r·min-1離心5 min后棄上清，加入500 μL Binding Buffer混勻后，加入5 μL Annexin V-FITC，再加入5 μL Propidium Iodide混勻；室溫避光反應(yīng)10 min；60 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.4 RANK蛋白測(cè)定 各組接種于6孔板，每組6孔，各組含藥血清培養(yǎng)48 h后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞移入蛋白裂解液。加入5X SDS-PAGE loading buffer，水煮變性蛋白，冷卻后-20 ℃保存?zhèn)溆谩＝?jīng)蛋白定量后，各組取等量蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE。將載有各組蛋白的PVDF膜投入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉/BSA封閉緩沖液中，室溫?fù)u床孵育2 h。加入1∶800稀釋的RANK一抗，4 ℃過(guò)夜。去掉一抗溶液，洗液TBS-T洗膜3次，每次10 min。加入1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，37 ℃搖床孵育1 h。去掉二抗溶液，用洗液洗膜5次，用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，測(cè)出各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，各組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞觀察及鑒定 RAW264.7細(xì)胞通過(guò)M-CSF+RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)5d后，出現(xiàn)大量不規(guī)則形多核細(xì)胞，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)顆粒細(xì)小，分布均勻，胞漿伸出許多細(xì)長(zhǎng)的偽足樣突起，見(jiàn)圖1（1）。TRAP染色結(jié)果示，細(xì)胞胞漿部位可見(jiàn)紫紅色沉淀，細(xì)胞核染色成陰性，而陰性對(duì)照組則未見(jiàn)紫紅色，見(jiàn)圖1（2）、圖1（3）。提示RAW264.7細(xì)胞通過(guò)M-CSF+RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)5 d后可獲得足量破骨細(xì)胞。

3.2 各組破骨細(xì)胞凋亡率 溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低、中、高劑量組在早期和晚期凋亡率與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。溫陽(yáng)補(bǔ)腎方高劑量組在早期和晚期凋亡率分別與低劑量組、中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；中劑量組與低劑量組在晚期凋亡百分率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2、表1。

3.3 Western Blot檢測(cè)RANK蛋白的表達(dá) 溫陽(yáng)補(bǔ)腎方低、中、高劑量組RANK蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；溫陽(yáng)補(bǔ)腎方高劑量組<中劑量組<低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；溫陽(yáng)補(bǔ)腎方中劑量組與低劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

4 討 論

隨著激素的廣泛使用，激素已經(jīng)遠(yuǎn)超過(guò)酒精成為股骨頭壞死最主要的致病因素[5]。SANFH是由多因素綜合作用而導(dǎo)致骨壞死和股骨頭機(jī)械結(jié)構(gòu)的破壞，而破骨細(xì)胞是唯一具有骨吸收功能的多核巨細(xì)胞。Rauner等[6]認(rèn)為，超生理劑量的糖皮質(zhì)激素可以刺激破骨細(xì)胞分化及增強(qiáng)其吸收活性，并可以抑制其凋亡，延長(zhǎng)其生命周期，在SANFH的病程中發(fā)揮重要作用。另外，糖皮質(zhì)激素還可以促進(jìn)膠原纖維溶解，使吸收陷窩里礦物質(zhì)的膠原纖維減少，從而影響破骨細(xì)胞脫落遷移到新的吸收點(diǎn)，使吸收陷窩變深、變寬，從而增強(qiáng)局部的骨吸收活性。Hong等[7]認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素可抑制破骨細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性。本實(shí)驗(yàn)從干預(yù)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞方面闡述溫陽(yáng)補(bǔ)腎方治療SANFH機(jī)制。破骨細(xì)胞是高代謝的終末分化細(xì)胞，以往采用的長(zhǎng)骨機(jī)械分離法獲得破骨細(xì)胞，分離純化較為困難，且不能增殖和傳代，難以獲取大量高純度破骨細(xì)胞，故本實(shí)驗(yàn)選用誘導(dǎo)RAW264.7前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。結(jié)果顯示，M-CSF 20 ng·mL-1+RANKL

40 ng·mL-1聯(lián)合誘導(dǎo)可得到大量破骨細(xì)胞，TRAP染色呈陽(yáng)性。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡的方法有多種，其中磷脂結(jié)合蛋白Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色最為常用。正?；罴?xì)胞（圖2左下象限）帶負(fù)電的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，不能被AnnexinV-FITC或PI染色。細(xì)胞凋亡的早期，由于細(xì)胞膜失去對(duì)稱性，PS從胞膜的內(nèi)側(cè)暴露于胞膜外，成為巨噬細(xì)胞清出凋亡細(xì)胞識(shí)別的標(biāo)志。凋亡早期細(xì)胞（圖2右下象限）仍保持膜的完整性，碘化丙啶（PI）不能進(jìn)入細(xì)胞，而凋亡晚期和發(fā)生繼發(fā)壞死的細(xì)胞（圖2右上象限）可同時(shí)被Annexin V-FITC/PI著色，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙參數(shù)分析，能計(jì)算凋亡百分率[8]。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，溫陽(yáng)補(bǔ)腎方各劑量組含藥血清干預(yù)破骨細(xì)胞48 h后，各組破骨細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡，在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上各組右上象限多于右下象限，說(shuō)明細(xì)胞晚期凋亡多于早期凋亡，并且和溫陽(yáng)補(bǔ)腎方的劑量呈正相關(guān)性。而各組細(xì)胞除了凋亡外也有死亡，這可能是由于RAW264.7細(xì)胞經(jīng)多次傳代后，分化為破骨細(xì)胞的能力減弱[9]。

在破骨細(xì)胞分化、成熟過(guò)程中，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)發(fā)揮著極其重要的作用，RANK是一種腫瘤壞死受體蛋白，位于破骨前體細(xì)胞。RANKL與RANK結(jié)合，通過(guò)介c-Jun N-端激酶（JNK）、導(dǎo)激酶抑制子（IKK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38和src途徑，引起破骨細(xì)胞內(nèi)一系列酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使破骨細(xì)胞前細(xì)胞分化、存活、融合為成熟破骨細(xì)胞，活化并抑制其凋亡[10]。OPG是RANKL的餌受體，它與RANK競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RANKL，從而抑制破骨細(xì)胞分化成熟，并可誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞的凋亡。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所主也；髓者，腎精所生，精足則髓足，髓足者則骨強(qiáng)”。腎中精氣旺衰決定了骨骼的強(qiáng)弱，故應(yīng)用補(bǔ)腎類中藥可調(diào)控骨代謝。溫陽(yáng)補(bǔ)腎方（復(fù)方巴戟天合劑）是王和鳴教授經(jīng)驗(yàn)方，方中以巴戟天溫腎壯陽(yáng)、強(qiáng)壯筋骨為君，骨碎補(bǔ)、淫羊藿、鹿角膠等溫陽(yáng)補(bǔ)腎藥為臣，共奏溫通血脈、補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨之功效[11-12]。而在本研究前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，筆者建立大鼠SANFH模型，對(duì)其股骨頭骨陷窩率、成骨破骨細(xì)胞及膠原面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，中藥治療組表面有明顯增多的骨祖細(xì)胞或成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞排列整齊，軟骨下血管豐富。證明本方能激發(fā)成骨細(xì)胞活力，抑制破骨細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)骨的代謝，促進(jìn)新骨生長(zhǎng)，保持骨小梁的完整結(jié)構(gòu)，維持骨組織的力學(xué)框架，保護(hù)骨重建功能的順利進(jìn)行。魏迎辰[13]通過(guò)對(duì)建立兔SANFH模型，運(yùn)用投射電鏡觀察模型組股骨頭超微結(jié)構(gòu)：軟骨細(xì)胞多呈圓形狀，數(shù)量少且分布稀疏，外形多皺縮，細(xì)胞核固縮呈橢圓狀且染色質(zhì)邊聚，甚則核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)許多空泡樣脂滴形成，擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，多聚核糖體脫落，高爾基復(fù)合體較少。周圍膠原纖維排列稀疏且結(jié)構(gòu)紊亂。骨細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)聚集甚至核碎裂，多被巨大脂滴壓縮到一側(cè)，細(xì)胞壞死凋亡形成空骨陷窩，周圍的膠原纖維粗大且紊亂。而溫陽(yáng)補(bǔ)腎方中劑量組及溫陽(yáng)補(bǔ)腎方高劑量組，軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多，多數(shù)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰且豐富，線粒體發(fā)達(dá)，多數(shù)無(wú)細(xì)胞核邊聚碎裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，周圍膠原纖維分布排列致密且規(guī)則；并可以使SANFH兔血清OPG濃度上調(diào)及RANK和RANKL濃度下調(diào)，抑制破骨細(xì)胞的過(guò)度活化，恢復(fù)骨代謝動(dòng)態(tài)平衡[1-2]。吳淮等[14]認(rèn)為，健骨方防治股骨頭壞死的機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)OPG、RANKL水平來(lái)抑制破骨細(xì)胞活性、促進(jìn)成骨形成。鄭素玉等[15-17]研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天含藥血清可以明顯抑制RANK、CAII、NFAT2 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能及減少破骨細(xì)胞數(shù)量。劉梅潔[18]通過(guò)觀察左歸丸含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞分化調(diào)控因子OPG、RANKL的影響，推測(cè)中醫(yī)“腎主骨”理論可能是通過(guò)對(duì)OPG、RANKL的調(diào)節(jié)而達(dá)到“主骨”的作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用溫陽(yáng)補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)破骨細(xì)胞48 h后，Western Blot法檢測(cè)破骨細(xì)胞中RANK蛋白水平降低，打破RANKL與破骨細(xì)胞膜上特異性受體RANK的結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的分化成熟、減少破骨細(xì)胞數(shù)量，且溫陽(yáng)補(bǔ)腎方高劑量組含藥血清效果最佳。

本研究結(jié)果提示，溫陽(yáng)補(bǔ)腎方能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，通過(guò)減少破骨細(xì)胞數(shù)量來(lái)保持股骨頭機(jī)械結(jié)構(gòu)可能是其治療SANFH骨破壞作用機(jī)制之一。骨重建是維持骨組織代謝和力學(xué)功能的重要機(jī)制。破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收，而成骨細(xì)胞又不斷在原位形成新骨。下一步可建立成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系，觀察本方對(duì)成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞偶聯(lián)的影響，以揭示其治療SANFH的機(jī)制。

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收稿日期：2015-01-04；修回日期：2015-03-09