肉雞腸粘膜通透性模型的建立

黃啟亮 李丹 謝莉敏 程秀芳 劉虹

摘 ?要：為探討大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）O1、O2、O78混合感染前后，肉雞血內(nèi)毒素（LPS）、D-乳酸含量變化，建立了肉雞腸粘膜通透性模型。使用大腸桿菌混菌（1×1011CFU/ml，劑量）感染，用不同濃度的抗生素（頭孢噻呋）誘導(dǎo)血內(nèi)毒素、D-乳酸的釋放，檢測血內(nèi)毒素、D-乳酸含量變化。結(jié)果感染后抗生素誘導(dǎo)組、鹽水組血內(nèi)毒素含量均高于感染前，且差異顯著（P<0.05）;感染組組雞血D-乳酸含量明顯增加，并且24h時，感染組抗生素低劑量組與感染鹽水組比較差異極顯著（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：大腸埃希菌;內(nèi)毒素;D-乳酸;抗生素

中圖分類號：S831.1 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2015）06-0003-04

腸粘膜通透性是指腸粘膜上皮容易被某些分子物質(zhì)以簡單擴(kuò)散的方式通過的特性。正常生理條件下，機(jī)體可通過腸粘膜屏障來有效地阻止致病微生物侵入腸道以外的組織、器官， 保證機(jī)體處于健康狀態(tài)。在疾病、藥物作用、營養(yǎng)因素等條件下可引起腸粘膜通透性的改變。腸粘膜通透性增大到一定程度時，細(xì)菌[1]和內(nèi)毒素經(jīng)受損腸粘膜進(jìn)入體循環(huán)，循環(huán)中內(nèi)毒素又通過各種機(jī)制再作用于腸粘膜，腸粘膜上皮細(xì)胞間的連接物質(zhì)失去屏障作用，對腸腔內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素等大分子物質(zhì)的通透性增加，形成惡性循環(huán)， 造成多器官功能損害。

目前，人的腸粘膜通透性的研究較為深入，有很多成熟的病灶模型[2]作為研究的基礎(chǔ)，在測定方法上也很明確，且在家畜上鮮見關(guān)于腸粘膜通透性的研究的相關(guān)報道，但在家禽上腸粘膜通透性研究未見報道，只是在概念層面上的推測與分析。原因是，D-乳酸 （D-LA）作為檢測腸粘膜通透性的指標(biāo)[3]，研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物血液中沒有快速降解它的酶，所以由腸道進(jìn)入血液的D-乳酸的含量多少可以作為評價腸粘膜通透性大小的指標(biāo)，而禽類血液中有沒有快速降解D-乳酸的酶目前存在爭議。本文對肉雞進(jìn)行大腸桿菌混菌（O1、O2、O78）[4]的攻毒，然后進(jìn)行抗生素誘導(dǎo)[5]，觀察分析血內(nèi)毒素、D-乳酸含量，依據(jù)內(nèi)毒素釋放量與腸粘膜通透性的關(guān)系，建立測定雞腸粘膜通透性指標(biāo)的平臺。

1 ?材料與方法

1.1 ?菌株 ?禽大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）O1、O2、O78（山東寶來利來生物工程菌種保藏中心提供）。

1.2 ?試驗動物 ?60只1日齡的黃羽肉雛雞，購自泰安市東岳種禽公司;全價飼料購于六和集團(tuán)。

1.3 ?試劑 ?頭孢噻呋（廣東紫金正天藥業(yè)有限公司，魯藥字C20127190782017）;內(nèi)毒素、D-乳酸測定試劑盒（上海酶聯(lián)試劑公司）。

1.4 ?試驗方法

1.4.1 ?動物分組 ?將60只42日齡健康雞隨機(jī)分成5組，分別為抗生素高劑量誘導(dǎo)組、抗生素中劑量組、抗生素低劑量組、空白對照組、鹽水組，每組12只。

1.4.2 ?分組處理 ?42日齡肉雞除空白對照組外，其余各組進(jìn)行大腸桿菌混菌（1×1011CFU/ml，劑量）灌胃攻毒，每天1次，連續(xù)灌胃2d，第3天進(jìn)行不同劑量抗生素（40、100、200mg/kg）灌胃。

1.4.3 ?血清制備 ?為動態(tài)觀察肉雞LPS、D-乳酸含量變化，抗生素灌胃后（12、24、48、96h）使用去熱源肝素鈉真空采血管翅下采集血樣，2000rpm離心10min，無熱源槍頭吸取上清液轉(zhuǎn)移至無熱源玻璃管-20凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 ?指標(biāo)測定 ?采用ELISA雙抗夾心免疫法測定內(nèi)毒素、D-乳酸含量。

1.5 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計 ?所用試驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）的方式表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 20.0軟件。

2 ?結(jié)果分析

2.1 ?病理剖檢、組織學(xué)觀察 ?試驗組肉雞感染后出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、精神沉郁、采食量減少、多數(shù)縮頭不起的典型致病菌E.coli感染癥狀，進(jìn)行了病理剖檢、組織學(xué)觀察。腸道、肝臟變化見圖1、圖2、圖3、圖4。

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病理剖檢觀察結(jié)果由圖1～4可見：腸腫脹出血，腸道充血，肝臟包膜增厚，表面淤血;正常組雞只飲水、采食等狀況良好，剖檢觀察由圖片可見肝、腸道均無病理癥狀。

組織切片觀察發(fā)現(xiàn)（圖5、圖6），模型組炎性細(xì)胞浸潤，被膜有纖維素浸出物，被膜下有細(xì)胞變性、壞死;正常組無病理癥狀。

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試驗結(jié)果表明，與對照組比較，試驗組出現(xiàn)腹瀉，采食量減少，縮頭不起，剖檢發(fā)現(xiàn)致病性E.coli感染典型癥狀。

2.2 ?血內(nèi)毒素含量變化 ?見表1。

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由表1可見，感染后抗生素誘導(dǎo)組、鹽水組血內(nèi)毒素含量均高于感染前，其中，低劑量48h、96h，中劑量的48h，高劑量的96h與對照組比較差異極顯著，說明感染后增加了腸道內(nèi)毒素的釋放進(jìn)入血液;感染后的抗生素誘導(dǎo)組普遍高于鹽水組，同一時段比較，48h低劑量組、中劑量組顯著高于鹽水組，96h低劑量、高劑量組顯著高于鹽水組，說明感染后抗生素的誘導(dǎo)導(dǎo)致內(nèi)毒素的更大量的釋放;試驗組中，抗生素低劑量組內(nèi)毒素含量相對較高，說明低劑量抗生素的使用誘導(dǎo)較多內(nèi)毒素的釋放。

2.3 ?D-乳酸含量變化 ?見表2。

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由表2可見，感染組雞血D-乳酸含量明顯增加，感染鹽水組48h時與感染前比較差異顯著，攻毒組抗生素低劑量組24、48h與感染前比較差異極顯著，并且24h時，感染組抗生素低劑量組與感染鹽水組比較差異極顯著。

從表1、2結(jié)果可見，抗生素低劑量誘導(dǎo)組雞只血D-乳酸值測定發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血內(nèi)毒素含量較高時，腸粘膜通透性增加，血D-乳酸含量也相應(yīng)在較高水平，同樣內(nèi)毒素含量較低時，血D-乳酸含量也較低，即存在正相關(guān)性。

有研究表明，D-乳酸作為哺乳動物檢測腸粘膜通透性的指標(biāo)，是因為哺乳動物體內(nèi)沒有快速降解D-乳酸的酶，所以血液中D-乳酸的含量就是通過腸粘膜進(jìn)入血液的含量，間接反映腸粘膜通透性，但家禽類血液中是否還有快速降解D-乳酸的酶沒有相關(guān)報道。從以上實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血液中內(nèi)毒素含量與D-乳酸的含量存在正相關(guān)性，即初步判定D-乳酸作為雞腸粘膜通透性變化監(jiān)測的一個指標(biāo)。

3 ?結(jié)論

致病性E.coli混菌感染導(dǎo)致肉雞嚴(yán)重腹瀉，伴有精神沉郁、采食量減少、多數(shù)縮頭不起的典型致病菌E.coli感染癥狀，肝臟組織切片顯示肝臟細(xì)胞浸潤、肝竇淤血，成功建立腹瀉模型。模型組進(jìn)行抗生素誘導(dǎo)后增加了腸源性內(nèi)毒素進(jìn)入血液，且低劑量（40mg/kg）抗生素更能誘導(dǎo)內(nèi)毒素的釋放，發(fā)現(xiàn)肉雞血液中D-乳酸的含量于內(nèi)毒素含量存在正相關(guān)關(guān)系，即基本判定D-乳酸作為雞腸粘膜通透性變化監(jiān)測的一個指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]郝慶紅，郭云霞，吳國江，等.雞源益生菌JM-11菌株的胃腸道耐受及其抗腹瀉的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報， 2011，20（1）：338-342.

[2] ?王瑞君，黃雪峰，唐歡，等.抗生素誘導(dǎo)的胃腸道菌群失調(diào)動物模型的建立[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，3（16）： 145-149.

[3] ?王峰，趙瑛.D-乳酸與腸道屏障功能[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（4）：423-424.

[4] ?徐倩倩，馬利芹，張曉利，等.白頭翁素對PRV、E-coli混合感染性腹瀉腸道超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（19）：13-17.

[5] ?涂健.抗生素和內(nèi)毒素誘發(fā)雞腸源性大腸桿菌易位的實驗研究[C].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué).