透骨消痛膠囊干預(yù)兔膝骨關(guān)節(jié)炎蛋白多糖與MMP—2、MMP—13表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

陳賽楠等

【摘 要】目的：通過(guò)透骨消痛膠囊對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)多糖與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-13表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步探討該藥保護(hù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)的作用機(jī)制。方法：將72只新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，奧泰靈組，透骨消痛膠囊低、中、高劑量組，每組12只。除空白對(duì)照組外，其余各組均采用改良Hulth法造模，造模后5周給予藥物治療，灌胃8周。甲苯胺藍(lán)染色、AB-PAS染色觀(guān)察軟骨蛋白多糖的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)MMP-2、MMP-13的表達(dá)。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組甲苯胺藍(lán)染色、AB-PAS染色顯著減弱，MMP-2、MMP-13表達(dá)顯著升高。與模型對(duì)照組比較，透骨消痛膠囊組甲苯胺藍(lán)染色、AB-PAS染色均勻深染，MMP-2、MMP-13表達(dá)顯著降低。結(jié)論：透骨消痛膠囊可通過(guò)下調(diào)軟骨MMP-2、MMP-13表達(dá)，減緩軟骨基質(zhì)降解，降低軟骨損傷程度，延緩骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；透骨消痛膠囊；蛋白多糖；MMP-2；MMP-13

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.07.001

Experimental Study on Tougu Xiaotong Capsule（透骨消痛膠囊） Interfering in the

Expression of Proteoglycan，MMP-2 and MMP-13 in Rabbits with Knee Osteoarthritis

CHEN Sai-nan，HUANG Yun-mei，CHEN Wen-lie，HUANG Mei-ya，WU Guang-wen，LIN Yu，

LIN Ru-hui，LI Xi-hai，YU Chao，F(xiàn)ENG Fang-fang，LI Xiao-dong，LIU Xian-xiang

【ABSTRACT】Objective：By study on Tougu Xiaotong Capsule （透骨消痛膠囊） interfering in the expression of proteoglycan，MMP-2 and MMP-13 in rabbits with knee osteoarthritis to further explore the action mechanism of the drug to protect cartilage matrix.Methods：72 New Zealand rabbits were randomly divided into a blank control group，a model control group，an Aotailing （Glucosamine Hydrochloride Capsules） group，and Tougu Xiaotong Capsule groups （low，medium and high dose groups）.Except for the blank control group，models were established in the other groups with modified Hulth method，and treated with drugs after 5 weeks—given intragastric administration for 8 weeks.Toluidine blue staining and AB-PAS staining were used to observe the expression of cartilage proteoglycan，and Western Blot was used to detect the expression of MMP-2 and MMP-13.Results：Compared with the blank control group，Toluidine blue staining and AB-PAS staining in the model control group were significantly weakened，while the expression of MMP-2 and MMP-13 significantly increased.Compared with the model control group，Toluidine blue staining and AB-PAS staining in the Tougu Xiaotong Capsule groups were homogeneously hyperchromatic and the expressions of MMP-2 and MMP-13 were significantly decreased.Conclusion：By the down regulation of the expressions of MMP-2 and MMP-13，Tougu Xiaotong Capsule can slow down the degradation of cartilage matrix，reduce the severity of cartilage injury，and delay the pathological process of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；Tougu Xiaotong Capsule（透骨消痛膠囊）；proteoglycans；MMP-2；MMP-13

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是常見(jiàn)的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，病理變化涉及軟骨、滑膜、軟骨下骨等，是多結(jié)構(gòu)、全方位關(guān)節(jié)病變，其發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。軟骨退變是OA最基本的變化，其損傷將進(jìn)一步促進(jìn)軟骨下骨結(jié)構(gòu)破壞，在病程中占核心地位。

軟骨基質(zhì)的合成與分解代謝的失衡，在OA軟骨變性損傷中起重要作用[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）屬鋅離子依賴(lài)性的內(nèi)切蛋白水解酶家族，廣泛存在于各種結(jié)締組織中，在軟骨基質(zhì)的正常代謝與病理降解中起重要作用[3-4]；其中MMP-2可將變性的Ⅱ型膠原進(jìn)一步裂解，膠原崩解、蛋白多糖降解，軟骨基質(zhì)破壞[5]，MMP-13可直接降解軟骨基質(zhì)中的Ⅱ型膠原，破壞骨架結(jié)構(gòu)[6-7]。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-13

的表達(dá)，調(diào)控基質(zhì)的降解速率，改善軟骨結(jié)構(gòu)，延緩OA病理進(jìn)程，已成為防治熱點(diǎn)。

透骨消痛膠囊由巴戟天、白芍、川芎、腫節(jié)風(fēng)組成，治療OA具有多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)[8]，有較好的臨床效果[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，該復(fù)方可抑制軟骨細(xì)胞凋亡[10]，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[11]及細(xì)胞外基質(zhì)合成[12]，抑制炎癥因子表達(dá)[13-14]，改善軟骨結(jié)構(gòu)與功能[15]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)透骨消痛膠囊治療新西蘭大白兔膝OA模型，并以鹽酸氨基葡萄糖作為陽(yáng)性對(duì)照藥，分析其在體內(nèi)對(duì)軟骨蛋白多糖的保護(hù)作用及MMP-2、MMP-13表達(dá)的影響，探討其治療OA的相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6月齡新西蘭大白兔72只，雌性，體質(zhì)量（2.0±0.3）kg，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2012-0011，合格證編號(hào)：2007001101785。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2009-0001，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 透骨消痛膠囊是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（閩制字Z20100006），鹽酸氨基葡萄糖膠囊（奧泰靈，香港澳美制藥廠(chǎng)生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：HC20110004，規(guī)格0.75 g）。

2 方 法

2.1 分組、造模、灌胃、取材 取新西蘭大白兔72只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，奧泰靈組，透骨消痛膠囊低、中、高劑量組，每組12只。除空白對(duì)照組外，其余5組均按照改良Hulth法建立OA模型，麻醉后右膝關(guān)節(jié)屈曲90 °，取內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板。術(shù)后1周起，強(qiáng)迫動(dòng)物運(yùn)動(dòng)，每日30 min，共4周，OA模型建立。

術(shù)后第5周起，奧泰靈組給予鹽酸氨基葡萄糖膠囊75 mg·kg-1·d-1灌胃；透骨消痛膠囊低、中、高劑量組分別給予透骨消痛膠囊0.93，1.86，

3.72 g·kg-1·d-1灌胃，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)8周。分別于灌胃后4周、8周取材，各取6只動(dòng)物股骨。

2.2 甲苯胺藍(lán)染色 取股骨內(nèi)髁，4%多聚甲醛固定，10% EDTA-PBS脫鈣。修切約1.2 cm×

1.2 cm×0.5 cm大小，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，矢狀面為切面，切片4 ?m。切片脫蠟，0.5%甲苯胺藍(lán)染液染色30 min，光鏡下觀(guān)察酸性蛋白多糖表達(dá)。每張切片選取5個(gè)不同視野，50倍鏡下拍照，Motic Med 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)分析甲苯胺藍(lán)平均光密度。

2.3 AB-PAS（阿爾新藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)）染色 切片脫蠟，3%醋酸3 min，1%AB染液染色

60 min；1%過(guò)碘酸10 min；Schiff染液染色20 min；

光鏡下觀(guān)察酸性、中性蛋白多糖表達(dá)。每張切片選取5個(gè)不同視野，50倍鏡下拍照，Motic Med 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)分析AB、PAS平均光密度。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot） 取股骨外髁軟骨，提取總蛋白，BCA蛋白定量。取20 ?g蛋白上樣，SDS-PAGE電泳分離，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶封閉；分別用1∶200的MMP-2或MMP-13

第一抗體、1∶8000的β-actin第一抗體，置4℃搖床上孵育過(guò)夜；TBST洗膜，分別加入相應(yīng)的第二抗體，室溫?fù)u床孵育1 h；TBST洗膜，曝光顯影；采用BIO-RAD Image Lab圖像處理軟件，分析灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨蛋白多糖甲苯胺藍(lán)染色觀(guān)察 造模術(shù)后9周（治療4周），空白對(duì)照組軟骨中上部呈深藍(lán)紫色，為透明軟骨；下部呈淺藍(lán)紫色，為軟骨鈣化層；二者之間為潮線(xiàn)；軟骨下骨呈淡藍(lán)色，鈣化層與軟骨下骨之間為粘合線(xiàn)，清晰可見(jiàn)，見(jiàn)圖1（1）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組染色重度減弱，呈淡藍(lán)色，見(jiàn)圖1（2），蛋白多糖含量顯著降低

（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，奧泰靈組染色中重度減弱、呈淺藍(lán)紫色，染色較均勻，見(jiàn)圖1（3），蛋白多糖含量未見(jiàn)顯著提升；透骨消痛膠囊低、高劑量組染色輕度減弱、染色均勻，見(jiàn)圖1（4）、

1（6），蛋白多糖含量升高（P < 0.01）；透骨消痛膠囊中劑量組染色未見(jiàn)丟失、呈深藍(lán)紫色，染色均勻，見(jiàn)圖1（5），蛋白多糖含量顯著升

高（P < 0.01）。

造模術(shù)后13周（治療8周），空白對(duì)照組軟骨呈淺藍(lán)紫色，考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然衰老，蛋白多糖分泌減少，甲苯胺藍(lán)染色減弱，見(jiàn)圖2（1）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組軟骨大面積失染、不著色，見(jiàn)圖2（2），蛋白多糖含量顯著降低（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，奧泰靈組染色重度減弱，見(jiàn)圖2（3），蛋白多糖含量未見(jiàn)提升；透骨消痛膠囊低、高劑量組淺表層染色重度減弱，輻射層呈淡紫色，見(jiàn)圖2（4）、2（6）；透骨消痛膠囊中劑量組染色呈深藍(lán)紫色、染色均勻，且染色強(qiáng)于同期空白對(duì)照組，見(jiàn)圖2（5），中劑量可促進(jìn)蛋白多糖合成分泌

（P < 0.01）。甲苯胺藍(lán)染色平均光密度見(jiàn)表1。

3.2 軟骨蛋白多糖AB-PAS染色觀(guān)察 治療4周，空白對(duì)照組：AB將軟骨淺表層染成淡紫紅色、鈣化層染成深紫紅色，PAS將移行層、輻射層染成湖藍(lán)色，見(jiàn)圖3（1）、圖4（1）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組AB、PAS染色均重度減弱，淺表層、鈣化層呈淡粉色，輻射層呈淡藍(lán)色，見(jiàn)圖3（2），

蛋白酸性多糖含量顯著降低（P < 0.01），中性多糖顯著降低（P < 0.05）；與模型對(duì)照組比較，奧泰靈組染色中重度減弱，鈣化層呈淡紫紅色，移行層、鈣化層呈淺藍(lán)色，染色較均勻，見(jiàn)圖3（3），蛋白多糖含量未見(jiàn)提升；透骨消痛膠囊組：染色未見(jiàn)明顯丟失，染色均勻，見(jiàn)圖3（4）、3（5）、3（6），蛋白多糖含量呈提升趨勢(shì)，以中劑量組對(duì)酸性多糖改善效果最為顯著（P < 0.05）。

治療8周，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組輻射層、鈣化層呈深紫紅色，移行層呈淺湖藍(lán)色、染色中度減弱，見(jiàn)圖4（2），酸性多糖含量顯著降

低（P < 0.05）。與模型對(duì)照組比較，奧泰靈組輻射層、鈣化層呈深紫紅色，移行層呈深湖藍(lán)色，見(jiàn)圖4（3），多糖含量未見(jiàn)提升；透骨消痛膠囊組：低劑量組淺表層、小部分輻射層、鈣化層呈深紫紅色，移行層、輻射層大部分呈深湖藍(lán)色，見(jiàn)圖4（4）；中劑量組染色與空白對(duì)照組相似，見(jiàn)圖4（5），多糖含量呈提升趨勢(shì)（酸性多糖P < 0.01，中性多糖P < 0.05）；高劑量組淺表層、鈣化層呈淡紫紅色，移行層、輻射層呈淡藍(lán)色，染色中度減弱，見(jiàn)圖4（6），多糖含量未見(jiàn)提升。AB-PAS染色平均光密度見(jiàn)表2。

3.3 MMP-2、MMP-13相對(duì)表達(dá)量 治療4周，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組MMP-2、MMP-13

表達(dá)量顯著升高（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，奧泰靈組、透骨消痛膠囊組MMP-2、MMP-13表達(dá)量顯著降低（P < 0.01）。治療8周，各組間未見(jiàn)顯著變化趨勢(shì)。見(jiàn)表3、圖5。

治療4周，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組MMP-13表達(dá)量顯著升高（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，奧泰靈組、透骨消痛膠囊組MMP-13表達(dá)量顯著降低（P < 0.01）。治療8周，各組間未見(jiàn)顯著變化趨勢(shì)。見(jiàn)表3、圖5。

4 討 論

軟骨組織由軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)組成；軟骨細(xì)胞是唯一細(xì)胞，主要功能是合成、分泌軟骨基質(zhì)；軟骨基質(zhì)主要由蛋白多糖、Ⅱ型膠原組成。膠原纖維構(gòu)成基質(zhì)網(wǎng)狀骨架，蛋白多糖填充其中，結(jié)合透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素等，形成毛刷樣結(jié)構(gòu)，具有良好親水性、抗壓性；兩者共同維持軟骨形態(tài)。軟骨細(xì)胞變性壞死、基質(zhì)合成降解代謝失衡，可導(dǎo)致OA的發(fā)生。

MMPs是降解軟骨基質(zhì)的主要酶系，MMPs的異常表達(dá)，引起蛋白多糖降解、膠原骨架斷裂，導(dǎo)致軟骨變性破壞，在OA病理進(jìn)程中起重要作用。MMPs屬內(nèi)切蛋白水解酶家族，根據(jù)不同的作用底物，分5個(gè)亞型。①膠原酶：MMP-1、MMP-8、

MMP-13。②明膠酶：MMP-2、MMP-9。③基質(zhì)溶解素：MMP-3、MMP-10、MMP-11。④膜型：MMP-14、MMP-15、MMP-16。⑤多相亞群：MMP-7、MMP-12、MMP-18。MMP-2降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型膠原，參與膠原骨架的破壞，可特異性降解變性的Ⅰ、Ⅱ型膠原片段，膠原崩解、蛋白多糖裂解，軟骨組織彈性降低、結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)一步加速OA病程[16]。MMP-13是MMPs家族中作用底物最廣，對(duì)Ⅱ型膠原的降解能力最強(qiáng)，可直接降解軟骨基質(zhì)膠原骨架，是OA早中期基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶[17-18]。

甲苯胺藍(lán)是常用于蛋白多糖染色的堿性染料，可與軟骨基質(zhì)中酸性蛋白多糖相結(jié)合，呈藍(lán)紫色，故本染色可用于蛋白多糖的半定量分析。AB是堿性染料，可與軟骨基質(zhì)中含陰離子集團(tuán)的蛋白多糖結(jié)合，呈湖藍(lán)色；PAS染色可與軟骨基質(zhì)中糖原結(jié)合，呈紫紅色；軟骨基質(zhì)呈紅藍(lán)相間，清晰顯示酸性、中性蛋白多糖。甲苯胺藍(lán)染色、AB-PAS染色可顯示OA病程中軟骨基質(zhì)蛋白多糖的分布與含量的變化。

軟骨組織形態(tài)學(xué)顯示，OA模型處于中后期，造模術(shù)后9周，MMP-2、MMP-13表達(dá)顯著上升，甲苯胺藍(lán)染色、AB-PAS染色重度減弱，蛋白多糖含量降低，顯示基質(zhì)成分降解。經(jīng)藥物治療4周后，透骨消痛膠囊組MMP-2、MMP-13表達(dá)量顯著降低，蛋白多糖含量增加，顯示其對(duì)軟骨基質(zhì)良好的保護(hù)作用。造模術(shù)后13周，模型對(duì)照組MMP-2、MMP-13表達(dá)較前均下降；甲苯胺藍(lán)染色、AB-PAS染色大面積失染，顯示基質(zhì)顯著破壞。經(jīng)藥物治療8周后，透骨消痛膠囊組MMP-2、MMP-13表達(dá)未見(jiàn)顯著變化，甲苯胺藍(lán)染色、AB-PAS染色深于模型對(duì)照組，以中劑量組最為顯著，且優(yōu)于奧泰靈組，顯示中劑量可促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成分泌，較好地維持軟骨結(jié)構(gòu)。

綜上所述，透骨消痛膠囊治療OA，可通過(guò)下調(diào)MMP-2、MMP-13表達(dá)以調(diào)控蛋白多糖、膠原等基質(zhì)成分的降解速率，維持軟骨基質(zhì)的形態(tài)，減緩軟骨變性損傷程度，改善軟骨形態(tài)，這可能是該藥對(duì)OA軟骨的保護(hù)機(jī)制之一。

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（下轉(zhuǎn)第60頁(yè)）

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收稿日期：2015-05-23；修回日期：2015-06-19