壓熱—酶法制備紫薯抗性淀粉的工藝優(yōu)化

李寶瑜　鄭寶東　曾紹?！∴崄嗻P

摘 要 為了提高紫薯抗性淀粉的含量，以紫薯淀粉為原料，采用壓熱-酶法制備紫薯抗性淀粉，通過單因素試驗，研究了淀粉乳濃度、普魯蘭酶用量、酶解時間、壓熱時間對紫薯抗性淀粉含量的影響。利用正交方法優(yōu)化了壓熱-酶法制備紫薯抗性淀粉的最佳工藝條件。結果表明：普魯蘭酶用量、壓熱時間對紫薯抗性淀粉的含量影響顯著（p<0.05）；制備紫薯抗性淀粉最佳工藝為：淀粉乳濃度30%、酶用量1 U/g淀粉、酶解時間12 h、壓熱時間45 min；在此條件下，所得紫薯抗性淀粉含量為17.16%，較單一壓熱法提高了67.74%。說明經過普魯蘭酶的脫支協(xié)同處理，能進一步提高紫薯抗性淀粉的含量，這對紫薯抗性淀粉的制備有一定應用價值。

關鍵詞 紫薯；抗性淀粉；壓熱酶法

中圖分類號 TS23 文獻標識碼 A

Abstract Using purple potato starch as the raw material，the resistant starch was prepared through the autoclave combined with enzyme hydrolysis treatment to improve the the yield of resistant starch prepared. To optimize the processing conditions，the effects of starch concentration，pullulanase dosage，reaction time，and autoclaving time value on the production rate of resistant starch were studied. The result showed that the dosage of pullulanase and autoclaving time had significant effects on the resistant starch production（p<0.05）. The orthogonal method was applied for the processing optimization and the highest production of purple potato resistant starch reached to 17.16% with the followed conditions：starch concentration of 30%，the dosage of 1 U/g，reaction time of 12 h and reaction time of 45 min. Compared with the autoclave method，the yield of resistant starch prepared from the method combined with enzyme increased by 67.74%. This suggests that the resistant starch prepared through the autoclave combined with enzyme hydrolysis treatmen would improve the the yield. It has certain application value on the purple potato resistant starch preparation .

Key words Purple sweet；Resistant starch；Autoclave combined with enzyme treatment

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.024

抗性淀粉（RS）是指在健康人體小腸內不能被消化吸收，但能在大腸中發(fā)酵或部分發(fā)酵的淀粉及其降解產物[1]?？剐缘矸劭煞譃?類：RS1（物理包埋抗消化性淀粉），RS2（抗性淀粉顆粒），RS3（回生淀粉），RS4（化學改性淀粉）[2]。有研究結果表明，RS具有一系列獨特的生理功能，如促進免疫功能、對糖尿病的預防功能及調節(jié)腸道菌群等[3]。早期許多關于RS的研究主要集中于它在大腸中所產生短鏈脂肪酸（SCFA）上，近年來國內外的研究焦點是RS作為益生元的潛力[4]。目前已知的益生元主要有多糖、低聚果糖，以及其它抗性低聚糖，如菊糖類型的果聚糖?？剐缘矸圩鳛橐环N膳食碳水化合物，能毫無變化地通過小腸進入大腸，并在大腸中發(fā)酵產生短鏈脂肪酸和其他產物。大量研究證實，抗性淀粉具有促進雙歧桿菌、乳桿菌明顯增殖的作用[5-6]，也有可能作為益生菌生長底物的來源，這可能與抗性淀粉能完全逃避小腸消化密切相關。目前RS的制備方法主要有壓熱處理法、脫支降解法以及復合法等，一般采用壓熱法制備抗性淀粉時，常與酶法協(xié)同進行。普魯蘭酶（Pullulanase）是異淀粉酶的一種，能切開支鏈淀粉分支點的a-1，6糖苷鍵，從而使淀粉的水解產物中含有更多游離的直鏈淀粉分子。已有研究發(fā)現，經過普魯蘭酶脫支處理后更有利于抗性淀粉的生產[7]。

薯類淀粉中紫薯淀粉糊化溫度高，熱穩(wěn)定性和凝膠性好[8]，是制備粉絲、粉皮等的良好原料。紫薯淀粉的直鏈淀粉含量高于甘薯和木薯[8-9]，而目前的研究表明，直鏈淀粉含量越高則越易老化返生并生成抗性淀粉[10]。這為紫薯抗性淀粉的制備提供了理論依據。本研究以紫薯淀粉為原料，采用壓熱-酶法制備紫薯抗性淀粉，在單因素試驗的基礎上，利用正交法優(yōu)化，確定制備紫薯抗性淀粉的最佳工藝條件，為今后紫薯抗性淀粉的制備及應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紫薯，產自福建長樂。

1.1.2 試劑 抗性淀粉酶試劑盒[包括：淀粉葡糖苷酶AMG（3 300 U/mL）、胰α-淀粉酶、GOPOD試劑緩沖液、GOPOD試劑酶和D-葡萄糖標準溶液]（愛爾蘭Megazyme 公司）；普魯蘭酶（1 000 u/g）[杰能科（中國）生物工程有限公司]；二水氯化鈣、疊氮化鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、氫氧化鉀均為分析純。

1.1.3 儀器設備 MJ-60BM01A美的攪拌機（廣東美的生活電器制造有限公司）；SYQ-DSX-280B型高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SHA-B型水浴恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；HQ-60型漩渦分離器（北方同正生物技術發(fā)展有限公司）；PB-10 pH計[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；PL602-L分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；L-530型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；UV-2000型紫外分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 紫薯淀粉的提取 將新鮮的紫薯洗凈去皮后，切成小塊，放入攪拌機中，以1 ∶ 3料液比加水攪拌，薯漿經100目絹布過濾，所得薯泥再加水攪拌重復過濾3遍，將淀粉全部洗到濾液中[11]；靜置6 h后棄上清液，用蒸餾水洗滌下層沉淀；繼續(xù)靜置6 h后，棄上清液，將下層沉淀置于45 ℃烤箱中干燥12 h，粉碎，過100目篩，即得紫薯淀粉樣品。

1.2.2 紫薯抗性淀粉的制備工藝 （1）壓熱法制備：稱取10 g紫薯淀粉，加入一定量的蒸餾水，配制成濃度為30%的淀粉乳，pH為6；預糊化后，放入高壓滅菌鍋中，于110 ℃下處理45 min；取出冷卻至室溫，并將樣品放入4 ℃冰箱中，冷藏24 h；取出回生的淀粉，于60 ℃下烘干16 h；粉碎，過100目篩。

（2）壓熱-酶法制備：稱取10 g紫薯淀粉，加入蒸餾水，配制成一定濃度的淀粉乳，調節(jié)pH為4.8，加入一定量的普魯蘭酶，置于60 ℃恒溫水浴鍋中酶解一定時間后，以95 ℃滅酶15 min，之后調pH為6；繼而放入高壓滅菌鍋中，于110 ℃下處理一定時間；取出冷卻至室溫，并將樣品放入4 ℃冰箱中，冷藏24 h，取出回生的淀粉，于60 ℃下烘干16 h；粉碎，過100目篩。

1.2.3 單因素試驗方案 選取不同的紫薯淀粉乳濃度（15%、20%、25%、30%、35%、40%）、普魯蘭酶用量[0.5、1、2、4 、8 U/g淀粉（以干基淀粉計算）]、酶解時間（1、2、6、12、18、24 h）、壓熱時間（10、20、30、40、50 min）4個因素對樣品進行糊化處理，每組做3個平行實驗，考察各個因素對紫薯抗性淀粉含量的影響。

1.2.4 抗性淀粉含量測定 采用Megazyme公司的抗性淀粉酶測定試劑盒，根據AOAC2002.02標準方法測定抗性淀粉含量。

往樣品中加入α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG），于37 ℃振蕩水浴孵育16 h，在這期間，通過2種酶的聯合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育結束后，加入等體積的乙醇或工業(yè)甲基化酒精（IMS，變性乙醇）終止反應；離心上述溶液，收集上清，底部殘留絮狀團即為樣品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%V/V）洗滌絮狀團，洗滌后離心，再重復洗滌離心1次，收集離心后獲得的上清，與之前收集的上清混合；小心倒出試管殘留的液體，將絮狀團置于冰水浴中，加入2 mol/L KOH溶解，溶解的同時用磁力攪拌機劇烈攪拌；用醋酸鹽緩沖液將這個溶液調至中性，用AMG將淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/過氧化物酶試劑（GOPOD）測定，這也是對樣品中RS含量（%）的測定；非抗性淀粉（可溶性淀粉）的測定：將集中的上清液定容至100 mL，再用GOPOD測定D-葡萄糖。

2 結果與分析

2.1 工藝條件對紫薯抗性淀粉含量的影響

2.1.1 不同淀粉乳濃度對紫薯抗性淀粉含量的影響 由圖1可知，當淀粉乳濃度為30%時，紫薯抗性淀粉含量達到最高，相對于其它濃度有顯著差異。過高或過低的淀粉乳濃度都不利于抗性淀粉的形成[12]。淀粉乳濃度大于30%時，由于水分含量過低，淀粉乳黏度很大，不利于直鏈淀粉分子相互接近，故此時紫薯抗性淀粉含量較淀粉乳濃度為30%時低。而當水分含量較高時，也不利于抗性淀粉的形成，這是由于淀粉濃度太低，直鏈淀粉相互接近的概率減少，容易出現部分糊化現象[13]。

2.1.2 不同普魯蘭酶用量對紫薯抗性淀粉含量的影響 由圖2可知，當普魯蘭酶用量為2 U/g淀粉時，紫薯抗性淀粉含量達到最高。普魯蘭酶的添加量過大或不足都不利于抗性淀粉的生成[14]。當酶用量過大時，會使淀粉分子脫支過度，形成短的直鏈淀粉鏈及低聚糖，無法形成抗性淀粉，故當普魯蘭酶用量超過2 U/g淀粉時，抗性淀粉含量呈下降趨勢；而當酶用量不足時，淀粉分子脫支不完全，支鏈淀粉的支叉結構阻礙直鏈淀粉互相接近，也會降低抗性淀粉的含量[15]。因此，綜合考慮普魯蘭酶脫支時間與普魯蘭酶添加量，選取2 U/g淀粉的普魯蘭酶添加量較為合適。

2.1.3 不同酶解時間對紫薯抗性淀粉含量的影響 由圖3可知，當普魯蘭酶作用時間為12 h時，紫薯抗性淀粉含量達到最高，相對于其它普魯蘭酶作用時間有顯著差異。有研究發(fā)現[16]，在淀粉的結晶過程和雙螺旋結構形成過程中均需要合適的鏈長，脫支時間過短，普魯蘭酶作用不充分，脫支效果差；脫支時間過長，淀粉脫支過度，也會降低抗性淀粉含量，即太短或太長的分子鏈均不利于抗性淀粉的生成，這與本研究所得的結論一致。

2.1.4 不同壓熱時間對紫薯抗性淀粉含量的影響 由圖4可知，當壓熱時間為40 min時，紫薯抗性淀粉含量達到最高，但相對于壓熱時間30 min理差異并不顯著。在其它條件相同的情況下，壓熱時間過短時，直鏈淀粉分子不易接近或沒有完全游離出來；壓熱時間過長時，淀粉分子會過度降解，形成短直鏈淀粉，這些短直鏈淀粉分子運動比較激烈，較難聚集形成晶體，不利于抗性淀粉的形成或形成的抗性淀粉抗酶解性不強，使其含量下降[17]。故當壓熱時間大于40 min時，紫薯抗性淀粉含量沒有提高，反而呈下降趨勢。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗方案確定 在單因素試驗基礎上，采用L9（34）正交表進行4因素3水平的正交試驗，獲得制備紫薯抗性淀粉的工藝參數最優(yōu)組合。試驗因素水平設計見表1。

2.2.2 正交試驗結果分析 根據表1確定試驗方案，以抗性淀粉的含量為指標進行正交試驗，試驗數據如表2所示。由表2與表3可以看出，紫薯抗性淀粉最高含量可達到16.03%。影響壓熱-酶法制備紫薯抗性淀粉的反應條件中各因素主次為：B（酶用量）>D（壓熱時間）>C（酶解時間）>A（淀粉乳濃度），最佳因素組合為A2B1C2D3即淀粉乳濃度30%、酶用量1 U/g淀粉、酶解時間12 h、壓熱時間45 min。普魯蘭酶用量是其中最重要的影響因素。試驗表明，控制普魯蘭酶的作用條件非常重要。

紫薯淀粉經過壓熱結合酶脫支后，抗性淀粉含量明顯有所提高，此工藝條件下制備的抗性淀粉含量為16.03%。采用此工藝進行驗證試驗，所得的RS平均含量為17.16%，證明此參數組合確為最佳工藝。

2.3 壓熱法與壓熱-酶法對紫薯抗性淀粉含量影響

由表4可知，普通壓熱法制備所得紫薯抗性淀粉含量為10.23%。壓熱-酶法制備的紫薯抗性淀粉含量為17.16%，較壓熱法制備的提高了67.74%。說明經過普魯蘭酶脫支處理后更有利于抗性淀粉的生產。同時也表明RS的含量不僅由直鏈淀粉含量決定，也跟直鏈分子的分子量大小密切相關。

3 討論與結論

抗性淀粉主要是通過直鏈淀粉雙螺旋疊加（即直鏈淀粉重結晶）形成。淀粉糊在冷卻放置的過程中，淀粉分子靠近分子鏈的末端區(qū)域并相互纏繞產生雙螺旋結構，淀粉分子鏈進一步延伸并發(fā)生折疊卷曲，更有利于淀粉分子上的羥基形成螺旋之間的氫鍵，使淀粉糊充分老化[18]。壓熱法是目前制備抗性淀粉的一般方法，但得率較低。近年來有研究發(fā)現，通過采用多次壓熱-冷卻處理，可以提高抗性淀粉的含量[19]。然而，隨著壓熱-冷卻循環(huán)次數的增加，生產周期延長，抗性淀粉的生產成本也隨之增加。因此，在抗性淀粉的制備過程中，單一處理方法得到的抗性淀粉含量很低，在實際應用中可考慮多種技術聯合應用。一般采用壓熱法制備抗性淀粉時，常與酶法協(xié)同進行。韋秋玉[20]采用脫支和不脫支2種方法來制備抗性淀粉，木薯淀粉未經脫支而直接糊化回生，得到的抗性淀粉含量為2.68%；而在同樣淀粉濃度和糊化溫度條件下，增加普魯蘭酶的脫支處理，發(fā)現抗性淀粉含量明顯提高，達到5.63%。Hung等[7]發(fā)現經過脫支和老化處理，能顯著提高香蕉淀粉的抗性淀粉含量，香蕉原淀粉樣品中抗性淀粉含量為11.2%，而經脫支處理后淀粉中有較高含量的抗性淀粉（31.8%～48.1%）。由此可知，經普魯蘭酶脫支協(xié)同處理后更有利于抗性淀粉的生成。本研究利用壓熱法結合酶解處理制備紫薯抗性淀粉，單一壓熱處理制備所得紫薯抗性淀粉含量較低，僅為10.23%；而與普魯蘭酶協(xié)同進行制備，紫薯抗性淀粉含量提高了67.74%。本研究在減少循環(huán)次數的前提下，有效地提高了抗性淀粉的含量，縮短了生產周期，降低生產成本，為今后紫薯抗性淀粉生產提供一定的參考。

本研究通過單因素試驗和正交分析法對紫薯抗性淀粉制備條件進行優(yōu)化。經分析，對紫薯抗性淀粉含量影響顯著的因素是酶用量，其次是壓熱時間。最佳工藝條件為淀粉乳濃度30%，酶用量1 U/g淀粉，酶解時間12 h，壓熱時間45 min，在此工藝條件下得到的抗性淀粉含量為17.16%。

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