不同細(xì)胞破碎方法對肉牛、牦牛背最長肌

左惠心 韓玲 ?？颂m 王琳琳 張佳瑩 余群力

摘 要：采用液氮研磨、液氮研磨輔助超聲波破碎和液氮研磨輔助玻璃珠破碎3種細(xì)胞破碎方法對肉牛、牦牛背最長肌蛋白質(zhì)提取和雙向電泳圖譜效果的最佳方法進(jìn)行研究。在相同裂解液組成、等電聚焦程序、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）操作、銀染法染色等雙向電泳條件的處理下，通過Bradford法分別測定不同方法提取的肉牛和牦牛肉背最長肌中蛋白質(zhì)的含量，并采用PDQuest 8.0.1軟件對雙向電泳圖譜的效果進(jìn)行分析。結(jié)果表明：3種細(xì)胞破碎方法提取的肉牛和牦牛背最長肌蛋白質(zhì)含量差異顯著，其中液氮研磨輔助超聲波破碎法（（2.59±0.15）、（2.84±0.29）μg/μL）顯著高于其他2種方法，液氮研磨輔助玻璃珠破碎法（（2.01±0.04）、（2.21±0.02）μg/μL）顯著高于液氮研磨法（（1.77±0.11）、（1.95±0.19）μg/μL）。3種方法所得肉牛背最長肌雙向電泳圖譜的蛋白點(diǎn)個數(shù)分別為（279±19）、（581±15）、（363±21）個；所得牦牛肉雙向電泳圖譜的蛋白點(diǎn)個數(shù)分別為（292±15）、（596±12）、（385±17）個。3種方法中液氮研磨輔助超聲波破碎法提取的肉牛、牦牛背最長肌蛋白質(zhì)含量最高，數(shù)量最多，蛋白點(diǎn)分離程度最好，并且3種細(xì)胞破碎方法在牦牛背最長肌中提取的蛋白質(zhì)含量與肉牛背最長肌中提取的蛋白質(zhì)含量差異不顯著。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞破碎；肉牛；牦牛；背最長肌；蛋白質(zhì)提??；雙向電泳

Comparison of Different Cell Disruption Methods for Two-Dimensional Electrophoresis Analysis of Beef and Yak Muscle

ZUO Huixin， HAN Ling*， NIU Kelan， WANG Linlin， ZHANG Jiaying， YU Qunli

（College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Abstract： Three cell disruption methods， i.e.， liquid nitrogen grounding， liquid nitrogen grounding aided ultrasonication and liquid nitrogen grounding with glass beads were investigated to find the most appropriate one for the extraction and two-dimensional electrophoresis analysis of proteins in longissimus dorsi muscles of beef cattle and yak. The same lysis buffer was used in the different cell disruption methods and the two-dimensional electrophoresis analysis was performed using isoelectric focusing and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis （SDS-PAGE） by silver staining. The protein contents of longissimus dorsi muscles were determined by the Bradford method. Analysis of the two-dimensional electrophoresis images was conducted using using PDQuest 8.0.1 software. Results showed that the protein contents of beef and yak longissimus dorsi muscles with the three cell disruption methods were significantly different， （2.59 ± 0.15） and （2.84 ± 0.29） μg/μL， （2.01 ± 0.04） and （2.21 ± 0.02） μg/μL， and （1.77 ± 0.11） and （1.95 ± 0.19） μg/μL for liquid nitrogen grounding aided ultrasonication， liquid nitrogen grounding with glass beads and liquid nitrogen grounding， respectively. The numbers of protein spots in the electrophoresis images of beef longissimus dorsi obtained using these three cell disruption methods were （279 ± 19）， （581 ± 15） and （363 ± 21）， respectively， whereas those of yak longissimus dorsi were （292±15）， （596 ± 12） and （385 ± 17）， respectively. Among these three methods， liquid nitrogen grounding aided ultrasonication yielded the highest protein contents， the greatest number of proteins and the best separation of protein spots from beef and yak longissimus dorsi. No significant differences in the protein contents of beef and yak longissimus dorsi were observed among the three cell disruption methods.

Key words： cell disruption； beef muscle； yak muscle； longissimus dorsi muscles； protein extraction； two-dimensional electrophoresis

中圖分類號：TS252.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）07-0011-05

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201507003

雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）是一種從蛋白質(zhì)混合物中分離蛋白質(zhì)的重要方法，其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同在pH梯度膠內(nèi)進(jìn)行第一向等電聚焦分離，然后根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小，利用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行第二向分離，經(jīng)染色后得到二維的蛋白質(zhì)分布圖譜，能夠?qū)σ粋€細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)即蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析[1-2]。蛋白樣品的溶解是整個2-DE的第一步，因而直接影響2-DE的結(jié)果，樣品的溶解和制備應(yīng)該盡可能減少步驟，防止人為修飾并促進(jìn)樣品中全部蛋白質(zhì)的變性和還原[3]。為了能夠充分溶解樣品并研究細(xì)胞內(nèi)的全部蛋白質(zhì)，必須有效地進(jìn)行細(xì)胞破碎[4]。

組織細(xì)胞的破碎方法取決于樣品的特性[5-8]（如樣品的組成、堅韌程度、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡龋?，對于易于破裂的?xì)胞可以選擇溫和的裂解方法，而對堅硬的組織細(xì)胞和具有細(xì)胞壁的植物或微生物材料應(yīng)選擇劇烈的裂解方法，同時確保蛋白質(zhì)組分不被降解和丟失。本研究采用液氮研磨、液氮研磨輔助超聲波破碎和液氮研磨輔助玻璃珠破碎3種細(xì)胞破碎方法，對肉牛和牦牛背最長肌進(jìn)行蛋白質(zhì)提取及2-DE分離，旨在檢測不同細(xì)胞破碎方法對肉牛和牦牛背最長肌蛋白提取量及2-DE的蛋白點(diǎn)分離程度和分辨率的影響，以期建立最佳的肉牛、牦牛肉肌肉組織2-DE分離條件，為進(jìn)一步研究肉牛、牦牛肉肌肉蛋白質(zhì)組學(xué)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉牛和牦牛均取自甘肅省武威市天祝藏族自治縣，各采集12頭36～48月齡放牧牛的背最長肌，從屠宰場取得剛宰殺的樣品，立即用磷酸鹽緩沖液清洗表面血跡后轉(zhuǎn)到液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

尿素（carbamide）、硫脲（thiourea）、固相pH梯度膠條（pH 3～10，非線性凝膠，17 cm）、3-[（3-膽酰胺丙基）二乙胺]-1-丙磺酸 （3-[（3-cholamidopropyl） dimethylammonio]- 1-propanesulfonate，CHAPS）、二硫蘇糖醇（dethilthreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、三羥甲基氨基甲烷（tris-base） 美國

Sigma公司；丙酮、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PROTEAN i12 IEF型雙向電泳儀、mini-protein II型電泳槽 美國Bio-Rad公司；UV-250型紫外分光光度計 日本島津公司；TGL-24MC型臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司；JY92-IIDN型液氮研磨輔助超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份公司；CP214型電子天平 奧豪斯儀器有限公司；M205444型搖床

北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；DHG9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海越眾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞破碎方法

液氮研磨法[9]：將洗凈的研缽、杵、藥匙用錫箔紙包好，在250 ℃條件下高溫鼓風(fēng)干燥2 h。將研缽、杵、藥匙事先液氮預(yù)冷，研磨時注入液氮，待組織顆粒凍硬后研磨至粉末狀，期間需經(jīng)常補(bǔ)充液氮以保證研磨過程始終在液氮中進(jìn)行。

液氮研磨輔助超聲波破碎法：在充分進(jìn)行液氮研磨后，將細(xì)胞懸浮于等體積預(yù)冷的裂解液中，在超聲功率200 W、超聲0.5 s、停1 s，超聲時間20 min的條件下，用液氮研磨輔助超聲波短時間內(nèi)多次沖擊細(xì)胞懸液，注意不要產(chǎn)生泡沫。

液氮研磨輔助玻璃珠破碎法：在充分進(jìn)行液氮研磨后，將細(xì)胞懸浮于等體積預(yù)冷的裂解液中，每克細(xì)胞加入2 g預(yù)冷的玻璃珠置于錐形瓶中，170×g搖床振蕩2 min，冰浴2 min，累計處理20 min。

1.3.2 Bradford法蛋白質(zhì)含量測定[10]

以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，磷酸鹽緩沖液為空白，用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。在595 nm，分別測定光密度（optical density，OD），根據(jù)OD值與蛋白含量之間的線性關(guān)系，繪制出蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定待測蛋白溶液顯色后的OD595 nm值，參照BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測蛋白的含量。所有操作步驟均在室溫狀態(tài)完成。

1.3.3 雙向電泳條件

在肉牛和牦牛背最長肌中分別加入0.11倍體積的100% TCA至樣品中[11]，置于冰上10 min，再添加500 μL冰預(yù)冷的100% TCA至樣品中，置于冰上20 min。10 000×g離心30 min，小心取上清液，添加500 μL丙酮，10 000×g離心10 min，小心吸去上清。加入組織細(xì)胞裂解液（8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2 g/100 mL CHAPS（40 mmol/L Tris-base），離心取上清后分裝并保存在-80℃冰箱備用。在以下程序進(jìn)行等電聚焦：30 V×l2 h、200 V×1 h、500 V×1 h、1 000 V×1 h、2 000 V×1 h，5 000 V×1 h、8 000 V Gradient l h、8 000 V step-n-hold 6 h；表面溫度：20 ℃；膠條：80 μA。聚焦結(jié)束后，分別用含2g/100 mL DTT和2.5g/100 mL IAA的膠條平衡緩沖液（6 mol/L尿素、2 g/100 mL SDS、體積分?jǐn)?shù)20%甘油）平衡膠條各15 min。將平衡好的固定化pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）膠條轉(zhuǎn)移到體積分?jǐn)?shù)12.5%的二向凝膠上端，將電泳緩沖液倒入電泳槽中。設(shè)置電泳儀參數(shù)：100 W電泳2 h，然后150 W下電泳約10 h，直到溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部后關(guān)閉電泳，撥膠，用快速銀染法進(jìn)行膠的染色[12]。

1.3.4 圖像掃描分析

將凝膠放于圖像掃描器上，選擇透射模式，以300 dpi分辨率掃描16位灰度圖像，以tif格式存儲。設(shè)置優(yōu)化靈敏度、算符大小和背景噪音等參數(shù)，初步識別凝膠圖像中的點(diǎn)[13]。創(chuàng)建參考膠[14]，參考膠是用于膠圖之間匹配的基礎(chǔ)，同一組實(shí)驗(yàn)中的其他膠圖都與其進(jìn)行匹配。手工匹配部分蛋白點(diǎn)，然后由軟件自動匹配，再進(jìn)行手工校正，所得結(jié)果進(jìn)一步在參考膠中驗(yàn)證。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，不同平均值之間采用SAS 9.0軟件GLM程序中的S-N-K多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSA蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

采用Bradford方法對不同方法提取的肉牛、牦牛背最長肌蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，1 mg/mL BSA溶液作標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蛋白質(zhì)含量（μg/μL）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D595 nm值為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.005 8x+0.038 7（R2=0.987 7），由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.987 7，線性關(guān)系良好，可以用于肉牛、牦牛背最長肌蛋白含量的測定。

2.2 不同細(xì)胞破碎方法對肉牛和牦牛背最長肌蛋白含量的影響

表 1 不同細(xì)胞破碎方法提取背最長肌蛋白含量

Table 1 Protein contents of beef and yak longissimus dorsi muscles with different cell disruption methods

?g/?L

提取方法 肉牛 牦牛

液氮研磨法 1.77±0.11c 1.95±0.19 c

液氮研磨輔助

超聲波破碎法 2.59±0.15a 2.84±0.29a

液氮研磨輔助

玻璃珠破碎法 2.01±0.04b 2.21±0.02b

注：小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。

由表1可知，不同細(xì)胞破碎方法提取肉牛、牦牛背最長肌蛋白質(zhì)含量之間差異顯著（P<0.05），3 種細(xì)胞破碎方法在牦牛背最長肌中提取的蛋白質(zhì)含量均高于肉牛，且差異不顯著（P>0.05）。液氮研磨法、液氮研磨輔助超聲波破碎法和液氮研磨輔助玻璃珠破碎法提取的肉牛背最長肌蛋白質(zhì)含量分別為（1.77±0.11）、（2.59±0.15）、（2.01±0.04）μg/μL；3 種細(xì)胞破碎方法提取的牦牛背最長肌蛋白質(zhì)含量分別為（1.95±0.19）、（2.84±0.29）、（2.21±0.02）μg/μL。

3種細(xì)胞提取方法中，液氮研磨輔助超聲波破碎法得到的蛋白質(zhì)含量均顯著高于液氮研磨法和液氮研磨輔助玻璃珠破碎法（P<0.05），液氮研磨法所得蛋白質(zhì)含量最低，液氮研磨輔助玻璃珠破碎法得到的蛋白質(zhì)含量居中。

分析原因，只進(jìn)行液氮研磨時，由于不易破壞研磨物組織成分，仍有肉眼不易分辨的組織未將蛋白質(zhì)釋放完全，以至破碎效果不如液氮研磨輔助玻璃珠破碎法和液氮研磨輔助超聲波破碎法。玻璃珠破碎的原理是通過細(xì)胞懸浮液和珠子相互攪動，從而通過剪切力層之間的碰撞和滾動而使細(xì)胞破裂[15-17]，由于玻璃珠破碎法在振蕩時有可能出現(xiàn)溫度升高以至蛋白質(zhì)降解的情況，所以肉牛、牦牛背最長肌所提取的蛋白質(zhì)含量低于液氮研磨輔助超聲波破碎法。液氮研磨輔助超聲波破碎法效果最好，可能是因?yàn)榧?xì)胞在超聲波頻率大于20 kHz/s時有強(qiáng)烈的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)行超聲波處理時，超聲波的高頻振動與微生物細(xì)胞的振動不協(xié)調(diào)，造成細(xì)胞周圍環(huán)境局部真空，使細(xì)胞膜產(chǎn)生空穴作用[18-20]，從而使之破碎。超聲波破碎的效率取決于聲頻、聲能、處理時間、細(xì)胞濃度及細(xì)胞類型等[21]，使用超聲波必須注意的是控制強(qiáng)度在一定限度，即剛好低于溶液產(chǎn)生泡沫的水平，因?yàn)楫a(chǎn)生泡沫會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，過低的強(qiáng)度將降低破碎效率。實(shí)驗(yàn)證明在功率大于240 W時會產(chǎn)生泡沫，所以實(shí)驗(yàn)使用時功率選擇200 W，最大不超過220 W，在這附近做微小調(diào)整。此外，牦牛背最長肌所提取的蛋白質(zhì)含量略高于肉牛，說明牦牛肉背最長肌具有高蛋白的特點(diǎn)[22]，可能是牦牛為適應(yīng)高寒草地生態(tài)環(huán)境條件，為在空氣稀薄、牧草生長期短、氣候寒冷的惡劣環(huán)境條件下自如生活而特有的肉質(zhì)特征。

2.3 不同細(xì)胞破碎方法對肉牛和牦牛背最長肌雙向電泳圖譜的影響

A. 液氮研磨法；B. 液氮研磨輔助超聲波破碎法；C. 液氮研磨輔助玻璃珠破碎法。

圖 1 肉牛背最長肌不同細(xì)胞破碎方法的雙向電泳圖譜比較

Fig.1 2-DE images of proteins in beef longissimus dorsi muscle with different cell disruption methods

A. 液氮研磨法；B. 液氮研磨輔助超聲波破碎法；C. 液氮研磨輔助玻璃珠破碎法。

圖 2 牦牛背最長肌不同細(xì)胞破碎方法的雙向電泳圖譜比較

Fig.2 2-DE images of proteins in in yak longissimus dorsi muscle with different cell disruption methods

使用PDQuest 8.0.1圖像分析軟件進(jìn)行分析表明：液氮研磨法、液氮研磨輔助超聲波破碎法和液氮研磨輔助玻璃珠破碎法所得肉牛背最長肌雙向電泳圖譜的蛋白點(diǎn)個數(shù)分別為（279±19）、（581±15）、（363±21）個；3 種細(xì)胞破碎方法提取所得牦牛背最長肌雙向電泳圖譜的蛋白點(diǎn)個數(shù)分別為（292±15）、（596±12）、（385±17）個。由圖1～2可知，3 種方法中，液氮研磨輔助超聲波破碎法得到的電泳圖譜較清晰，蛋白點(diǎn)個數(shù)最多、分離較好，有利于下一步分析；液氮研磨輔助玻璃珠破碎法的電泳圖譜背景較干凈，蛋白斑點(diǎn)呈現(xiàn)得比較清晰，但蛋白點(diǎn)較少。猜測超聲處理可以更好地破碎細(xì)胞，同時超聲可能促進(jìn)一些脂類或其他無法去除的物質(zhì)的溶解，而玻璃珠破碎是純機(jī)械力，不會造成類似的結(jié)果，超聲樣品的背景略高于玻璃珠破碎法所得樣品，但總體差別不大。液氮研磨法的電泳圖譜清晰度較差，蛋白點(diǎn)少、不利于分析。因此，液氮研磨輔助超聲波破碎法是3 種方法中最為理想的牛肉、牦牛肉雙向電泳細(xì)胞破碎方法，該法使得樣品充分裂解，得到的蛋白質(zhì)含量較高。

3 結(jié) 論

采用液氮研磨、液氮研磨輔助超聲波破碎和液氮研磨輔助玻璃珠破碎3 種細(xì)胞破碎方法對肉牛、牦牛背最長肌蛋白質(zhì)提取和雙向電泳圖譜效果的最佳方法進(jìn)行研究，通過Bradford法分別測定不同方法提取的肉牛和牦牛背最長肌中蛋白質(zhì)的含量。就肉牛背最長肌中蛋白質(zhì)而言，液氮研磨輔助超聲波破碎法（（2.59±0.15）μg/μL）

顯著高于液氮研磨輔助玻璃珠破碎法和液氮研磨法，液氮研磨輔助玻璃珠破碎法（（2.01±0.04）μg/μL）顯著高于液氮研磨法（（1.77±0.11）μg/μL）；3種細(xì)胞破碎方法提取的牦牛背最長肌蛋白質(zhì)含量得到相同結(jié)論，其含量分別為（2.84±0.29）、（2.21±0.02）、（1.95±0.19）μg/μL。

采用PDQuest 8.0.1軟件對雙向電泳圖譜的效果進(jìn)行分析，液氮研磨法、液氮研磨輔助超聲波破碎法和液氮研磨輔助玻璃珠破碎法所得肉牛背最長肌雙向電泳圖譜的蛋白點(diǎn)個數(shù)分別為（279±19）、（581±15）、（363±21）個；3種細(xì)胞破碎方法提取的牦牛背最長肌雙向電泳圖譜的蛋白點(diǎn)個數(shù)分別為（292±15）、（596±12）、（385±17）個。3種方法中，液氮研磨輔助超聲波破碎法提取的肉牛、牦牛背最長肌蛋白質(zhì)含量最高，數(shù)量最多，蛋白點(diǎn)分離程度最好。確定了液氮研磨輔助超聲波破碎法是3種方法中最為理想的肉牛、牦牛雙向電泳細(xì)胞破碎方法。

3種細(xì)胞破碎方法在牦牛背最長肌中所提取的蛋白質(zhì)含量與肉牛背最長肌所提取的蛋白質(zhì)含量差異不顯著，但牦牛背最長肌蛋白質(zhì)含量均高于肉牛背最長肌蛋白質(zhì)含量，說明牦牛背最長肌具有高蛋白的特點(diǎn)，可能是牦牛為適應(yīng)高寒草地生態(tài)環(huán)境而特有的肉質(zhì)特征。

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