烏珠穆沁羊生長過程中骨骼肌MyHC基因變化

馮青輝 斯琴其木格 蘇和 朝格賽 薛寶玲 格日勒

摘 要：研究不同生長階段肉羊骨骼肌肌球蛋白重鏈（MyHC）基因相對表達(dá)量的變化規(guī)律，實(shí)驗(yàn)選擇自然放牧條件下的1、3、6、9、12、18月齡的烏珠穆沁羊，屠宰后采取股二頭肌、背最長肌，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）法分離骨骼肌中肌球蛋白重鏈異構(gòu)體，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)測定MyHC基因的相對表達(dá)量并探討其變化規(guī)律。結(jié)果表明：從SDS-PAGE圖中可以清晰地觀察到4條條帶分別為Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb型與Ⅰ型。其中烏珠穆沁羊股二頭肌和背最長肌中MyHC的Ⅰ型和Ⅱa型基因的相對表達(dá)量均高于Ⅱb型基因的相對表達(dá)量。

關(guān)鍵詞：烏珠穆沁羊；骨骼??；肌球蛋白重鏈基因；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

Changes in Myosin Heavy Chain （MyHC） Gene from Skeletal Muscle during the Growth of Wuzhumuqin Sheep

FENG Qinghui1， Siqinqimuge1， SU He2， CHAO Gesai3， XUE Baoling1， BORJIGIN Gerelt1，*

（1.College of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China；

2.Inner Mongolia Xilinhot Husbandry Bureau， Xilinhot 026000， China；

3.Inner Mongolia Xilinhgol Farming and Animal Husbandry Management， Xilinhot 026000， China）

Abstract： This study was aimed to investigate the changes in the relative expression level of myosin heavy chain （MyHC） gene from skeletal muscle during the growth of Wuzhumuqin sheep. Free-grazing Wuzhumuqin sheep were slaughtered at 1， 3， 6， 9， 12 and 18 months of age and the biceps femoris and longissimus dorsi muscles were excised. MyHC isoforms were separated from the muscles by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）， and the relative expression level of MyHC gene was measured by real-time polymerase chain reaction （PCR）. The results showed that four clear bands representing type Ⅱa， type Ⅱx， type Ⅱb and type Ⅰ， respectively， were observed in the electrophoretic pattern. The expression of MyHC type Ⅰ gene and type Ⅱa in biceps femoris and longissimus dorsi was higher than that of MyHC type Ⅱb gene. Understanding the MyHC gene expression in skeletal muscle during the growth of sheep is of great practical importance for improving meat quality and post-mortem physiological and biochemical characteristics.

Key words： Wuzhumuqin sheep； skeletal muscle； myosin heavy chain； real time-polymerase chain reaction （PCR）

中圖分類號：TS251.53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）07-0020-05

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201507005

骨骼肌是由多核細(xì)胞的肌纖維（肌細(xì)胞）組成。肌纖維由很多肌原纖維組成，而肌原纖維是由很多不同蛋白質(zhì)而構(gòu)成。其中肌球蛋白是一個由高度保守的多基因編碼，含有多種同工蛋白的家族，它也是骨骼肌的主要收縮蛋白[1]。肌球蛋白分子由2個肌球蛋白重鏈和兩對起調(diào)節(jié)作用的肌球蛋白輕鏈組成，具有ATPase活性[2]。在多種肌球蛋白同工型基因共同表達(dá)模式的作用下，肌纖維的表型呈多樣性[3]。依據(jù)肌球蛋白重鏈（MyHC）基因的類型可將肌纖維分為4種，即MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx，它們分別特征性的對應(yīng)4種不同類型的肌纖維Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb和Ⅱx。在代謝上分別與慢速氧化型、快速氧化型、快速酵解型和中間類型肌纖維相對應(yīng)[4-5]。肌纖維的類型及組成不僅決定了骨骼肌的生長發(fā)育，還會影響肉的生理生化特性及感官品質(zhì)[6-7]。目前，國內(nèi)外關(guān)于肌球蛋白重鏈基因表達(dá)規(guī)律的研究有很多。Changa等[8]指出肌球蛋白的分子類型依靠肌球蛋白重鏈相關(guān)基因來有效表達(dá)，通過MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx在骨骼肌上的表達(dá)和依據(jù)肌纖維與肌球蛋白重鏈的相關(guān)基因的特異性，動物骨骼肌肌纖維可對應(yīng)的進(jìn)行分型。楊曉靜[9]對豬骨骼肌生長及肌纖維類型分布的分子機(jī)理進(jìn)行了研究。楊飛云[10]

對豬骨骼肌肌纖維類型分布及轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理進(jìn)行了研究。郭佳等[11]研究了金華豬背最長肌中不同肌球蛋白重鏈基因表達(dá)的發(fā)育性變化。張輝等[12]研究了FoxO1、肌纖維類型標(biāo)志基因和MyHCⅠ、MyHCⅡb、MyHCⅡa和MyHCⅡx在特定骨骼肌中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO1在不同骨骼肌類型中mRNA表達(dá)差異不顯著（P>0.05），其蛋白表達(dá)與MyHC各亞型顯著相關(guān)。沈潔等[13]

研究了家兔骨骼肌肌球蛋白重鏈構(gòu)成的電泳。范曉華等[14]

研究了大鼠脊髓橫斷早期比目魚肌質(zhì)量與肌球蛋白重鏈亞型mRNA表達(dá)的變化。魯建清等[15]研究了骨骼肌肌球蛋白重鏈與不同類型訓(xùn)練的影響。辛雪等[16]研究了巴美肉羊肌球蛋白重鏈基因的表達(dá)規(guī)律。此外有關(guān)魚、牛和豬等動物身上也有較多的肌球蛋白重鏈基因研究報(bào)道[17-18]。

而有關(guān)對肉羊身上的研究很少，特別是肉羊生長過程中的肌球蛋白重鏈基因的表達(dá)研究極少。烏珠穆沁羊是我國優(yōu)良肉用品種，集中在烏珠穆沁區(qū)域，近幾年主要分布在錫林郭勒盟的東、西烏珠穆沁旗、阿巴哈納爾旗部分地區(qū)[19]。烏珠穆沁羊是經(jīng)過自然放牧和人工選擇逐步繁育而形成的內(nèi)蒙古地方優(yōu)良品種之一，屬肉用粗毛羊；具有體大、肉質(zhì)嫩、肉中脂肪含量適中、含有多種對人體有益的礦物質(zhì)并且發(fā)育生長迅速等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)對烏珠穆沁肉羊隨著月齡的增加MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx各基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，旨在掌握肉羊隨月齡的增加骨骼肌肌球蛋白重鏈基因的相對表達(dá)量的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

內(nèi)蒙古錫林郭勒盟自然放牧條件下的同一個羊群的烏珠穆沁羊各3 只，分別是1、3、6、9、12、18 月齡。將其屠宰后取股二頭肌和背最長肌，樣品分裝，然后液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80 ℃保存。

Tris試劑 南京博爾迪生物科技有限公司；丙烯酰胺、蔗糖 天津永大化學(xué)試劑廠；雙丙烯酰胺 上海紫一試劑廠；三氯甲烷 天津市科盟化工工貿(mào)有限公司；異丙醇 南京市新源化工；核酸染料 北京全式金生物技術(shù)有限公司；焦碳酸二乙酯、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 大連寶生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BG-power600型穩(wěn)流恒壓電泳儀 北京白晶生物技術(shù)有限公司；LHS-50CH恒溫恒濕箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ChampGel6000凝膠成像儀北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；BG-Qspin600轉(zhuǎn)微型離心機(jī) 北京百晶生物技術(shù)有限公司；CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量

PCR儀 美國Bio-Rad公司；DSH-300A型回旋式恒溫水浴振蕩器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

骨骼肌肌球蛋白的提取方法參考Light等[20]的方法。取去掉脂肪以及大塊結(jié)締組織的肌肉組織切成碎塊，稱取10 mg。向10 mg的肌肉組織中加入500 μL蛋白質(zhì)提取試劑Pro-Prep，3000V、0.3 min，勻漿3 次。將樣品冰上靜置30 min。4 ℃、13 000 r/min離心5min，分離上清液，并將其裝好放入-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SDS-PAGE電泳分離肌球蛋白重鏈異構(gòu)體

SDS-PAGE電泳分離肌球蛋白重鏈異構(gòu)體參考Light等[20]的方法進(jìn)行分離。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，待藍(lán)紫色線距離凝膠板底部2 cm處停止電泳。最后4 ℃染色約為2 h，4 ℃脫色，每1.5～2 h更換一次脫色液直至電泳條帶清晰。

1.3.3 總RNA的提取

總RNA的提取方法參考Trizol法[21]。取100～200 mg的烏珠穆沁羊的股二頭肌和背最長肌置于液氮中研磨，加液氮時(shí)應(yīng)迅速、少量多次，并且肌肉組織應(yīng)始終處于冷凍狀態(tài)下。將標(biāo)號1.5 mL無酶無菌EP管稱量、去皮，然后拿小藥匙取100 mg肌肉粉末放入其中。在1.5 mL無酶無菌EP管中加1 mL的Trizol，冰浴5 min。4 ℃、12 000 r/min，離心5 min，吸取上清液（約1 000 μL）。加200 μL氯仿（1/5體積），蓋緊管蓋，劇烈振蕩15 s，無分相沉淀后室溫靜置5 min。4 ℃、12 000 r/min，離心15 min（離心后勿振蕩或混勻）這時(shí)樣品分為3 層，上層為RNA、中間層為DNA、下層為蛋白質(zhì)。之后小心吸取上清液約500 μL轉(zhuǎn)移到新的無酶無菌EP管中。加入等體積異丙醇，上下混合均勻，室溫放置10 min。4 ℃、12 000 r/min，離心10 min后，得白色沉淀，丟棄上清。離心后可在管側(cè)壁和管底看見少量的RNA膠狀沉淀。管壁中加入焦碳酸二乙酯處理的75%乙醇1 mL，然后輕輕上下顛倒洗滌沉淀。4 ℃、12 000 r/min，離心5 min，棄上清。輕輕吹打沉淀，等RNA完全溶解后置于-80 ℃保存。分別取5 μLRNA溶液、2 μL緩沖液混勻，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測總RNA質(zhì)量的完整性，分析RNA的濃度和純度。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄

利用大連寶生物工程有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的指導(dǎo)說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，進(jìn)而合成cDNA。

1.3.5 引物設(shè)計(jì)及合成

在National Center For Biotechnology Information（NCFI）網(wǎng)中查找到綿羊肌球蛋白重鏈MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx各基因的核苷酸序列，然后應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件來對引物進(jìn)行分析，之后由博覽特生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和合成。

1.3.6 PCR條件優(yōu)化

由于目的基因PCR引物長度的最適退火溫度與PCR反應(yīng)體系的最適退火溫度不同，cDNA濃度也不同，導(dǎo)致在做實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)前，對PCR反應(yīng)體系來進(jìn)行溫度梯度實(shí)驗(yàn)，以此來探究最佳退火溫度。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用CFX96TMReal Time System實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)來進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。用反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，看家基因β-actin為內(nèi)參，每個樣品進(jìn)行3個重復(fù)。Real-Time PCR體系中熒光物質(zhì)的特異性與目的基因的目的片段來進(jìn)行結(jié)合，CFX96TMReal Time System實(shí)時(shí)的PCR系統(tǒng)收集到熒光信號量與PCR產(chǎn)物量成正比。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)總體系為25μL，其中：滅菌ddH2O 8.5μL，cDNA的模板2μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5μL。

采用兩步法來進(jìn)行PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s，60℃退火30s，總共40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)采用2-ΔΔCt公式計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的質(zhì)量評定

用1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測總RNA質(zhì)量的完整性。圖1是股二頭肌總RNA瓊脂糖凝膠電泳，圖2是背最長肌總RNA瓊脂糖凝膠電泳。電泳檢測的結(jié)果顯示28S、18S、5S條帶較為清晰，說明RNA幾乎沒有被降解，可在cDNA的合成和RT-PCR中使用。

圖 1 股二頭肌總RNA質(zhì)量鑒定結(jié)果

Fig.1 Identification of total RNA isolated from biceps femoris

圖 2 背最長肌總RNA質(zhì)量鑒定結(jié)果

Fig.2 Identification of total RNA isolated from longissimus dorsi

2.2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

圖 3 普通RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

由圖3可知，普通RT-PCR擴(kuò)增出的MyHC基因的Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx型和β-actin基因長度分別為165、200、216、284、233bp。能夠清晰地觀察到普通RT-PCR擴(kuò)增出的目的片段預(yù)期的大小，并且沒有其他條帶，這說明目的基因片段產(chǎn)生明顯的特異性擴(kuò)增條帶，所設(shè)計(jì)引物的特異性較好，符合后期RT-PCR實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 MyHCⅠ型基因在股二頭肌和背最長肌中的相對表達(dá)量

大寫字母不同，表示不同月齡、相同部位之間差異顯著（P<0.05）。下同。

圖 4 不同月齡烏珠穆沁羊股二頭肌和背最長肌中MyHCⅠ基因

mRNA相對表達(dá)量

Fig.4 Relative expression of MyHCⅠ mRNA in biceps femoris and longissimus dorsi of Wuzhumuqin sheep at different ages

由圖4可知，在股二頭肌中MyHCⅠ型基因的mRNA相對表達(dá)量有不同變化現(xiàn)象。1月齡>3月齡>6月齡>9月齡≈12月齡>18月齡，總體上1～18月齡有明顯的下降趨勢，但9、12月齡之間的差異不顯著。1、3、6、9、18月齡之間的差異顯著（P<0.05）。在不同的生長階段中背最長肌的MyHCⅠ型基因mRNA在6月齡時(shí)的相對表達(dá)量顯著較高于其他月齡段（P<0.05）。1、3、9月齡之間差異均不顯著。

2.4 MyHCⅡb型基因在股二頭肌和背最長肌中的相對表達(dá)量

由圖5可知，在不同生長階段MyHCⅡb型基因mRNA相對表達(dá)量在不同骨骼肌中的表達(dá)有所不同。在股二頭肌中，12月齡的相對表達(dá)量與其他月齡相比有顯著性差異（P<0.05），在3、6、18月齡之間的差異不顯著。不同生長階段背最長肌中MyHCⅡb型基因mRNA相對表達(dá)量變化在3月齡時(shí)有較高的表達(dá)量，與其他月齡相比有顯著性差異（P<0.05）。1月齡和6月齡之間差異不顯著，9、12、18月齡之間差異均不顯著。

圖 5 不同月齡烏珠穆沁羊股二頭肌和背最長肌中MyHCⅡb基因mRNA相對表達(dá)量

Fig.5 Relative expression of MyHCⅡb mRNA in biceps femoris and longissimus dorsi of Wuzhumuqin sheep at different ages

2.5 MyHCⅡa型基因在股二頭肌和背最長肌中的相對

表達(dá)量

圖 6 不同月齡烏珠穆沁羊股二頭肌和背最長肌中MyHCⅡa基因mRNA相對表達(dá)量

Fig.6 Relative expression of MyHCⅡa mRNA in biceps femoris and longissimus dorsi of Wuzhumuqin sheep at different ages

由圖6可知，在不同生長階段MyHCⅡa型基因的mRNA相對表達(dá)量在股二頭肌中的變化為18月齡>9月齡≈6月齡>3月齡≈12月齡>1月齡。1～18月齡有逐步升高的趨勢。18月齡相對表達(dá)量與其他月齡的表達(dá)量之間差異顯著（P<0.05）。3、12月齡差異不顯著。6、9月齡之間差異不顯著。不同生長階段MyHCⅡa型的基因mRNA相對表達(dá)量在背最長肌中的變化為9月齡>1月齡>12月齡≈18月齡>3月齡>

6月齡，9月齡與其他月齡之間差異顯著（P<0.05），12、18月齡之間差異均不顯著。

2.6 MyHCⅡx型基因在股二頭肌和背最長肌中的相對表達(dá)量

由圖7可知，在不同生長階段MyHCⅡx型基因mRNA的相對表達(dá)量在股二頭肌中的變化為12月齡>3月齡≈

18月齡>6月齡>1月齡>9月齡。12月齡與其他月齡之間差異顯著（P<0.05），3、18月齡之間差異不顯著

（P<0.05）。不同生長階段背最長肌中MyHCⅡx型基因mRNA相對表達(dá)量變化為9月齡>1月齡>12月齡≈18月齡>3月齡≈6月齡，9月齡的表達(dá)與其他月齡相比有顯著性差異（P<0.05），3、6、12、18月齡之間差異均不顯著。

圖 7 不同月齡烏珠穆沁羊股二頭肌和背最長肌中MyHCⅡx基因mRNA相對表達(dá)量

Fig.7 Relative expression of MyHCⅡx mRNA in biceps femoris and longissimus dorsi of Wuzhumuqin sheep at different ages

3 討 論

總體上看，不同類型的肌球蛋白重鏈基因的特異性表達(dá)與不同類型的肌纖維（不同部位骨骼?。┲g存在著對應(yīng)關(guān)系。本結(jié)果與Devoto等[22]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。家畜在它的生長以及運(yùn)動等過程中骨骼肌中不同肌球蛋白重鏈相關(guān)基因之間也存在著相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系，這種轉(zhuǎn)化關(guān)系也是導(dǎo)致不同類型肌纖維之間相互轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因素[23]。動物體肌纖維在色澤、直徑、供能方式、酶活性、收縮速度上存在差異。不同類型肌纖維的生長具有特異性，而且其受遺傳、營養(yǎng)和生活環(huán)境等因素的影響在生長過程中不斷發(fā)生轉(zhuǎn)化。事實(shí)上，各種肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈異形體在肌纖維中的分布并不是嚴(yán)格的局限于某種肌纖維或肌肉發(fā)育的特定階段。肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈異形體有多種多樣的結(jié)合形式，構(gòu)成了大量的肌球蛋白分子。肌肉中肌纖維類型的構(gòu)成、機(jī)能、形態(tài)學(xué)上的差異與酮體肉質(zhì)性狀、產(chǎn)肉量以及脂肪交雜、風(fēng)味等性能方面有著密切關(guān)系。例如，日本和牛是以優(yōu)良肉質(zhì)而聞名世界。研究表明，日本國內(nèi)產(chǎn)的肉用牛因品種的不同，肌纖維類型在特征上有很大的區(qū)別，即黑色和牛中荷爾斯泰因品種的βR型（紅色肌纖維）比褐色和牛的多，這可能與肉質(zhì)的改良有關(guān)系。另外，同一種黑色和牛中因飼養(yǎng)條件、產(chǎn)地等的不同，肌纖維類型也不同。肌纖維類型與產(chǎn)肉性質(zhì)，特別是體質(zhì)量增加和脂肪交雜的關(guān)系更值得重視；到目前為止還未明確的解析它們之間的關(guān)系。有研究表明動物出生后隨著生長發(fā)育肌纖維增大肌肉質(zhì)量也增加，白色肌纖維的直徑比紅色肌纖維變化大，從αR型肌纖維轉(zhuǎn)移αW型。有關(guān)動物出生后肌纖維的分化方面Ashmore等[24]指出，牛出生時(shí)所有肌纖維是紅色肌纖維，純紅色肌纖維的βR型不引起出生后分化，而αR型的一部分分化為αW型。這些因素可能關(guān)系到動物產(chǎn)肉量的增加。研究者們認(rèn)為通過育種、改良來增加肌肉質(zhì)量主要關(guān)系到白色肌纖維的構(gòu)成比率。肉質(zhì)，特別是脂肪交雜的肌肉，其中紅色肌纖維的比例越高優(yōu)質(zhì)的脂肪交雜越高，例如黑色和牛。因此，不同種類骨骼肌骨骼肌之間，肌內(nèi)蓄積脂肪含量比率有顯著差別。因此研究肌纖維的生成、結(jié)構(gòu)、類型及其轉(zhuǎn)化規(guī)律有著重要的實(shí)際意義。肌肉中肌纖維類型的組成對宰后肉品質(zhì)、生理生化等特性具有重要影響。

4 結(jié) 論

總體上烏珠穆沁羊股二頭肌中MyHCⅠ型基因的相對表達(dá)量高于MyHCⅡb型基因的相對表達(dá)量，并MyHCⅠ型和MyHCⅡa型基因的相對表達(dá)量高于MyHCⅡb型基因的相對表達(dá)量。烏珠穆沁羊不同生長階段背最長肌中除了3月齡外，其他月齡MyHCⅠ型和MyHCⅡa型基因的相對表達(dá)量都要高于MyHCⅡb型基因的相對表達(dá)量。

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