江蘇省沿海灘涂中華大蟾蜍種群的遺傳多樣性分析

王蘭萍等

摘要 [目的] 為中華大蟾蜍野生種群資源的保護和合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。[方法] 通過對中華大蟾蜍線粒體控制區(qū)的部分序列進行測序分析，研究江蘇沿海地區(qū)中華大蟾蜍不同地域種群的遺傳多樣性。[結(jié)果] 在江蘇省沿海灘涂的3個地域檢測到中華大蟾蜍種群的6個單倍型類型，東臺種群、大豐種群和射陽種群的個體間享有共享的單倍型類型，其余單倍型均是各種群獨享。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，中華大蟾蜍3個地域種群沒有形成明顯的地理分布格局。[結(jié)論] 各地域種群間既存在著一定程度的基因交流，也存在一定程度的遺傳分化。

關(guān)鍵詞：中華大蟾蜍；線粒體控制區(qū)；遺傳多樣性；系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號：S917 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-093-02

蟾蜍隸屬兩棲綱（Amphibia）、無尾目（Anura）、蟾蜍科（Bufonidae）、蟾蜍屬（Bufo），在我國各地均有分布，并且在不同海拔的各種生境中數(shù)量都較多。江蘇沿海地區(qū)中華大蟾蜍（Bufo gargarizans）和花背蟾蜍（Bufo raddei）都是江蘇沿海地區(qū)常見的蟾蜍種類[1]，喜棲息于水邊、草叢等陰暗潮濕的地方。它們不僅是農(nóng)作物害蟲的天敵，而且是一種動物源藥材蟾酥的來源。筆者通過對中華大蟾蜍線粒體控制區(qū)的部分序列進行測序分析，探討江蘇省沿海地區(qū)中華大蟾蜍不同地域種群的遺傳多樣性，以期為中華大蟾蜍野生種群資源的保護和合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 中華大蟾蜍樣本采集自江蘇省鹽城市沿海灘涂地區(qū)，采用隨機抽樣的方法分別從東臺市、大豐市和射陽縣3個地域取樣，每個地域樣本數(shù)量均為10只。所有樣本帶回實驗室于-80 ℃下冷凍保存。

1.2 基因組DNA提取、mtDNA控制區(qū)PCR擴增及測序 剪取約0.5 g的中華大蟾蜍肌肉樣本，采用組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，TE溶解后-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

用于擴增mtDNA控制區(qū)序列的PCR引物參照文獻[2]，上、下游引物序列分別為P1：5′-GCACGATAGCAAGGAACAC-3′和P2：5′-CCGCTTTAAGGTACGATA-3′。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR擴增體系（50 μl）：5 μl 10×Buffer、4 μl 25 mmol/L MgCl2、4 μl 2.5 mmol/L dNTPs，10 pmol/μl 上游、下游引物各為1 μl，0.3 μl 5 U/μl Taq DNA 聚合酶、1 μl 100 ng/μl DNA模板，余下體積用滅菌超純水補足。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。

將PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用凝膠回收試劑盒回收純化，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行雙向測序。

1.3 DNA序列數(shù)據(jù)分析 所有測序獲得的DNA序列使用DNAstar軟件進行編輯、校對和排序，依據(jù)測序峰圖手工校正。各個群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性采用

DnaSP4.0[3]軟件計算；使用Clustal X1.83[4]軟件進行序列的比對，系統(tǒng)發(fā)育分析使用MEGA5.0軟件[5]，分別采用鄰接法（NJ）和最小進化法（ME）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自展法1000次重復(fù)抽樣估計系統(tǒng)樹中結(jié)點的置信水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA控制區(qū)序列特征 測序獲得的PCR擴增片段經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫中中華大蟾蜍線粒體基因組（NC_008410）比對分析表明，擴增的mtDNA控制區(qū)序列長度均為366 bp，未發(fā)現(xiàn)插入和缺失序列。測定的序列中共發(fā)現(xiàn)8個變異位點（圖1），包括6個簡約信息位點和1個單一變異位點；A、T、C、G堿基的平均含量分別為36.6%、31.3%、21.0%和11.1%。

單倍型分析表明，在東臺種群中檢測到4種類型（DT1、DT2、DT3），大豐種群中檢測到3種類型（DF1、DF2、DF3、DF4），射陽種群中檢測到3種類型（SY1、SY2、SY3）；東臺、大豐和射陽種群的單倍型多樣性分別為0.711、0.822和0.600，核苷酸多樣性則分別為 0.007 23、0.007 77和0.006 80（圖1）。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析 采用鄰接法和最大簡約法構(gòu)建的中華大蟾蜍mtDNA控制區(qū)單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖2所示。從圖2可以看出，2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)完全相同，只是在單倍型的分支順序上存在差異?；趩伪缎托蛄械姆肿酉到y(tǒng)發(fā)育樹分析表明，中華大蟾蜍的6種單倍型可分為2個分支，每個分支中均包含了東臺、大豐和射陽種群中的單倍型類型；東臺種群、大豐種群和射陽種群共享了1種單倍型，東臺種群和大豐種群、東臺種群和射陽種群還分別共享了其他的單倍型。這表明中華大蟾蜍3個地域種群沒有形成明顯的地理分布格局。

3 討論

遺傳多樣性不僅是形成生物多樣性的基礎(chǔ)，而且是物種進化潛能的保證。遺傳多樣性水平的下降可能導(dǎo)致物種對環(huán)境適應(yīng)能力的降低，這對生活在野外多變環(huán)境中的群體而言是一個極大的威脅[6-7]。因此，在基因水平上檢測種群的遺傳多樣性有助于了解物種的種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群歷史，進而了解其演化過程，最終有助于制定科學(xué)的保護策略。

該研究中從中華大蟾蜍種群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析表明，2個參數(shù)都是大豐種群最高，而射陽種群最低，表明大豐種群的遺傳多樣性最高而射陽種群的遺傳多樣性最低，而出現(xiàn)這種狀況可能與種群所處的環(huán)境相關(guān)。通常認為，當(dāng)1個種群在相當(dāng)長的時間內(nèi)比較穩(wěn)定且資源量豐富時，該種群可能會維持較高的遺傳多樣性。近年來，由于規(guī)?；难睾┩块_發(fā)、圍海造田以及化學(xué)污染，在一定程度上大幅度地減少并割裂了江蘇省沿海灘涂中華大蟾蜍的棲息地，過度的人工捕捉也造成了其野生種群數(shù)量的下降。特別是射陽灘涂受到的人為干擾程度最大，從而可能導(dǎo)致該地域內(nèi)中華大蟾蜍種群的遺傳多樣性水平下降。

在江蘇省沿海灘涂的3個地域檢測到中華大蟾蜍種群的6個單倍型類型，東臺種群、大豐種群和射陽種群的個體間享有共享的單倍型類型，其余單倍型均是各種群獨享，獨享單倍型的存在表明這些地域種群之間已呈現(xiàn)出一定程度的遺傳分化。采用不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹更進一步表明，3個不同種群的中華大蟾蜍分屬于2個不同的譜系，但這2個分支與地理分布不相關(guān)，表明中華大蟾蜍正處于譜系重排（Lineage sorting）階段而并沒有按采樣點的地理單元分開。這說明各地域種群間既存在著一定程度的基因交流，也存在一定程度的遺傳分化。

參考文獻

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