利用Gateway技術(shù)改造原核表達(dá)載體pGEX—4T—1、pET—28a

胡麗松 鄔華松 郝朝運(yùn) 譚樂和 范睿 吳剛

摘 ?要 ?質(zhì)粒載體是基因工程研究中不可或缺的工具。為提高載體構(gòu)建效率，進(jìn)一步滿足基因工程研究在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)的需要，本文提供了一種重組型載體的改造策略?；玖鞒倘缦拢豪脦glⅡ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)以及attB重組序列的引物，從Gateway的入門載體pDONR Zeo中克隆到“BglⅡ-attB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”片段。通過酶切連接的方法，將該片段插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1以及pET-28a的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建具有重組位點(diǎn)以及ccdB致死基因的原核表達(dá)載體。以胡椒High mobility group protein（HMGB）基因的開放讀碼框?yàn)槟繕?biāo)片段，通過重組反應(yīng)將目的基因構(gòu)建到改造后的原核表達(dá)載體上，經(jīng)檢測體外誘導(dǎo)表達(dá)出大小正確的HMGB蛋白，驗(yàn)證本研究中改造載體的正確性。該載體的成功構(gòu)建，為基因工程科研工作提供了一個(gè)高效的蛋白表達(dá)載體以及載體改造的新策略。

關(guān)鍵詞 ?Gateway技術(shù);載體改造;胡椒PnHMGB;原核表達(dá)

中圖分類號 ?Q936 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Modification of Prokaryotic Expression Vector

pGEX-4T-1， pET-28a by Using

Gateway Technology

HU Lisong1，2， WU Huasong1，2 *， HAO Chaoyun1，2， TAN Lehe1，2， FAN Rui1，2， WU Gang1，2

1 Spice and Beverage Research Institute，CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops / Hainan Provincial

Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulatioin for Tropical Spice and Beverage Crops，

Wanning， Hainan 571533， China

Abstract ?Plasmid vector is a necessary tools for gene engineering. In order to improve the efficiency of vector construction， a strategy for recombinant vector modification was presented. The process as follows： A“BglⅡ-attB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”sequence was cloned with 5`-BglⅡ-attB1 and 3`-XhoⅠ-attB2 extension primers from Gateway entry vector pDONR Zeo. Then the sequence was inserted into the multiple cloning site of pGEX-4T-1 and pET-28a to construct the new recombinant ccdB-selection E. coli expression vector. The open read frame（ORF）sequence of PnHMGB was cloned to the new pGEX-4T-1 and pET-28a vector by recombinant reaction. The results of PnHMGB expression in vitro verifies the correctness of vector modification. The successful vector modification supply an efficient E. coli expression vector and a new strategy for recombinant vector modification.

Key words ?Gateway technology; Vector modification; PnHMGB; Prokaryotic expression

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.014

天然質(zhì)粒是存在于受體細(xì)胞染色體外的一種裸露的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，廣泛存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞，是寄主染色體以外的非必要組成部分，隨著細(xì)胞的自我復(fù)制而分配到后代中。質(zhì)粒還具有DNA轉(zhuǎn)移性，能夠使遺傳物質(zhì)從一細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一細(xì)胞中。這些特點(diǎn)很好的符合了基因工程的研究需要，以質(zhì)粒為骨架構(gòu)建而成的載體統(tǒng)稱為質(zhì)粒載體[1]。目前構(gòu)建的質(zhì)粒載體有上百種，廣泛應(yīng)用的包括pCAMBIA系列真核表達(dá)載體，pET系列原核表達(dá)載體，pGEM-T克隆載體等[2]。

在質(zhì)粒載體的基本元件中，有一段包含多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的DNA短序列，這一片段稱為多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site，MCS）或多位點(diǎn)接頭（polylinker）。該元件是外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入載體的關(guān)鍵，通過合適的酶切位點(diǎn)，可以將一個(gè)或多個(gè)外源DNA片段插入到載體[3]。盡管目前多克隆位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)配置序列的酶切位點(diǎn)足夠豐富，但是實(shí)際的研究中會遇到目的基因片段與載體的酶切位點(diǎn)不匹配，致使目的基因片段插入載體相當(dāng)困難[4]。另外，利用限制性內(nèi)切酶和連接酶構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)需要對DNA進(jìn)行切割并回收目的片段，然后再用連接酶將其連接，這些操作使得傳統(tǒng)的酶切連接克隆技術(shù)在應(yīng)對大規(guī)模、高通量構(gòu)建需求時(shí)具有一定的局限性[5]。

為了克服用酶切連接技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體所遇到的問題，Invitrogen公司根據(jù)λ 噬菌體基因組和大腸桿菌基因組之間的位點(diǎn)專一性重組分子機(jī)制開發(fā)了一套分子克隆新技術(shù)，即Gateway克隆技術(shù)[6]。Gateway克隆技術(shù)是一種通用性的克隆方法，利用該技術(shù)可以快速、高效地將目的基因同時(shí)構(gòu)建到多種與 Gateway 技術(shù)兼容的載體系統(tǒng)，用于功能分析和蛋白質(zhì)表達(dá)[7-9]。它基于lambda噬菌體的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)（attB×attP→attL×attR），在目的片段兩端添加attB重組位點(diǎn)，將含attB重組位點(diǎn)PCR產(chǎn)物與含attP重組位點(diǎn)的入門載體混合，在BP酶的催化下發(fā)生反應(yīng)，把目的基因克隆到入門載體上，同時(shí)在入門載體上形成新的attL位點(diǎn)。含新的attL位點(diǎn)的入門載體在LR重組酶的催化下和含attR位點(diǎn)的表達(dá)載體發(fā)生反應(yīng)，從而達(dá)到將目的基因克隆到功能載體的目的[10-11]。與經(jīng)典克隆多個(gè)步驟相比，該方法只需一步生化反應(yīng)便能達(dá)到克隆目的，是高通量克隆基因的好方法。一旦構(gòu)建獲得包含目的基因的入門載體，這個(gè)入門克隆可以與任何Gateway下游目的載體進(jìn)行LR重組反應(yīng)，構(gòu)建多種表達(dá)系統(tǒng)，用于基因超量表達(dá)、基因沉默、啟動子分析、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位等研究[12-14]。另外，Gateway技術(shù)采用了致死基因ccdB的篩選方法，能確保高效率的分離陽性重組克隆[15]。盡管Gateway技術(shù)是高通量克隆基因的好方法，但由于專利等原因，Gateway后續(xù)表達(dá)系統(tǒng)不如經(jīng)典的表達(dá)載體高效。

本研究以整合Gateway重組技術(shù)克隆的高效性和傳統(tǒng)質(zhì)粒表達(dá)的穩(wěn)定性為目的，把帶重組位點(diǎn)的序列插入到原核表達(dá)載體pET-28a和pGEX-4T-1上，構(gòu)建具有重組位點(diǎn)及ccdB致死基因的原核蛋白表達(dá)載體。以胡椒HMGB開放讀碼框序列為目的片段，經(jīng)兩步重組構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-28a和pGEX-4T-1上，通過體外IPTG誘導(dǎo)，分別獲得帶His和GST標(biāo)簽的蛋白，驗(yàn)證了該方法的可行性和正確性，為改造質(zhì)粒載體提供一個(gè)新思路。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

質(zhì)粒及菌株入門載體pDONR Zeo購自Life Technologies公司;原核表達(dá)載體pGEX-4T-1購自Amersham公司;pET-28a購自Novagen公司;菌株TOP10、DB3.1、Rosetta由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室棉花課題組惠贈。

主要生化試劑：限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA擴(kuò)增酶購自New England Biolabs（NEB）公司;BP、LR重組酶，Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside（IPTG）、抗生素購自Life Technologies公司;蛋白質(zhì)電泳相關(guān)試劑購自伯樂（Bio-Rad）公司;PCR產(chǎn)物純化、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

引物：實(shí)驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的引物（表1）全部委托上海英駿生物技術(shù)有限公司（Invitrogen）合成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?重組ccdB序列克隆 ? 以BglⅡ-attB1序列為上游引物，XhoⅠ-attB2為下游引物，pDONR Zeo質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min），獲得“BglⅡ-attB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”片段，經(jīng)電泳檢測大小準(zhǔn)確后回收;回收產(chǎn)物克隆到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，提取陽性克隆質(zhì)粒，用BglⅡ、XhoⅠ在37 ℃ 、buffer 2體系進(jìn)行雙酶切反應(yīng)2 h，回收目的片段待用。

1.2.2 ?原核表達(dá)載體改造 ? 用BamHⅠ和XhoⅠ酶切pET-28a、pGEX-4T-1質(zhì)粒，酶切體系為BamHⅠ、XhoⅠ各1 μL，質(zhì)粒10 μg，buffer 2 μL，補(bǔ)雙蒸水至20 μL，37 ℃反應(yīng)2 h，電泳檢測后挖膠回收。將酶切、回收后的載體及“BglⅡ-aatB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”重組片段在T4連接酶的作用下16 ℃反應(yīng)10 h。反應(yīng)產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DB3.1感受態(tài)，通過博來霉素（100 μg/mL）篩選陽性菌落，經(jīng)PCR驗(yàn)證后，抽提質(zhì)粒，保存菌株（檢測引物見表1）。

1.2.3 ?原核表達(dá)載體驗(yàn)證 ? 根據(jù)研究室已構(gòu)建的胡椒葉片cDNA文庫信息，選擇PnHMGB基因作為驗(yàn)證基因，該基因編碼一個(gè)約18 ku的蛋白質(zhì)[16]。設(shè)計(jì)帶attB接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物通過天根試劑盒回收。用BP重組酶將回收的PnHMGB基因構(gòu)建到入門載體pDONR Zeo，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，挑取陽性克隆送公司測序，并抽提對應(yīng)陽性克隆質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒分別與改造后的pET-28a及pGEX-4T-1質(zhì)粒在LR重組酶的作用下將PnHMGB基因構(gòu)建到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆，并擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒。

構(gòu)建好的pET-28a-PnHMGB、pGEX-4T-1- PnHMGB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta（DE3），挑取陽性菌落，接入1 mL含抗生素（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。取100 μL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入10 mL含抗生素（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)，待OD600在0.5～0.7時(shí)，取1 mL培養(yǎng)物為對照，其余的加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，16 ℃震蕩培養(yǎng)8 h。取1 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)物及未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，離心收集菌體，用100 μL SDS聚丙烯酰胺溶液懸浮，高溫裂解后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?重組型ccdB序列克隆

利用PCR擴(kuò)增獲得重組ccdB序列，結(jié)果顯示重組ccdB片段大約1.8 kb，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小符合。將目標(biāo)片段克隆到T載體，將含有目的序列的T載體進(jìn)行BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物片段經(jīng)電泳檢測與克隆片段大小一致（圖1）。結(jié)果表明重組型ccdB序列被準(zhǔn)確克隆，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 ?載體改造與驗(yàn)證

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-28a及pGEX-4T-1質(zhì)粒。將含BglⅡ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的重組ccdB序列分別插入到pET-28a和pGEX-4T-1，構(gòu)建2個(gè)含重組位點(diǎn)的原核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DB3.1，用通用引物pGEX-F、pGEX-R、T7pro、T7ter進(jìn)行PCR檢測，如圖1所示，改造成功的原核表達(dá)載體比改造前大2 kb左右，通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物包含了300 bp左右的載體序列，因此PCR產(chǎn)物比重組ccdB序列稍大。這些結(jié)果表明重組ccdB序列已經(jīng)成功插入到原核表達(dá)載體上（圖1）。

2.3 ?胡椒PnHMGB原核表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證

PCR擴(kuò)增胡椒PnHMGB序列，測序結(jié)果顯示，該基因開放讀碼框共432 bp，編碼一個(gè)大小約為18 ku大小的蛋白（圖2）。選擇測序結(jié)果正確的克隆，擴(kuò)增帶重組位點(diǎn)的PnHMGB片段，在重組酶的作用下構(gòu)建到pDONR Zeo上。抽提pDONR Zeo-PnHMGB質(zhì)粒，在LR重組酶的作用下將胡椒PnHMGB序列從pDONR Zeo重組到pET-28a及pGEX-4T-1載體上。

抽提重組正確陽性質(zhì)粒，熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta（DE3），體外IPTG誘導(dǎo)PnHMGB表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明：PnHMGB在pET-28a載體誘導(dǎo)出20 ku左右的特異表達(dá)蛋白，pGEX-4T-1載體誘導(dǎo)表達(dá)出40 ku左右的特異表達(dá)蛋白。正常的PnHMGB蛋白大小為18 ku，在pET-28a載體中表達(dá)末端帶有6個(gè)His標(biāo)簽，所以大小應(yīng)該為20 ku，而在pGEX-4T-1載體中表達(dá)末端帶有23 ku大小的GST標(biāo)簽，因此大小應(yīng)該為42 ku，如圖3中紅色箭頭所示。通過2個(gè)載體的表達(dá)，確認(rèn)PnHMGB能在改造后的載體中成功表達(dá)，表明本研究采取的重組型載體改造的方法可行。

3 ?討論與結(jié)論

在基因功能驗(yàn)證的研究中，各種不同類型載體的構(gòu)建是研究的基礎(chǔ)之一。目前應(yīng)用最為廣泛的是基于酶切和連接反應(yīng)的DNA 重組技術(shù)，如pCAMBIA真核表達(dá)系列，pET原核表達(dá)系列等。這類載體在表達(dá)效率和穩(wěn)定性上得到研究者的肯定，目前被廣泛應(yīng)用在基因功能驗(yàn)證研究中。而在實(shí)際的應(yīng)用中，研究者根據(jù)不同需求對這類載體進(jìn)行一定的改造。潘求真等[17]利用雙酶切將pEGFP-N1質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)（MSC）去除，然后補(bǔ)平連接， 獲得增強(qiáng)型綠色熒光蛋白編碼基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MSC。為獲得無標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因植物、保證轉(zhuǎn)基因生物安全，周紅等[18]以pCAMBIA1300植物轉(zhuǎn)化載體為骨架，通過AseI單酶切去除潮霉素標(biāo)記基因，通過酶切片段的自連接反應(yīng)構(gòu)建了無標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因載體?；诿盖羞B接的方法，在載體啟動子改造、表達(dá)標(biāo)簽添加等方面被廣泛應(yīng)用[19-20]，但是，這類載體的構(gòu)建其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)是選擇合適的酶切位點(diǎn)。由于載體的多克隆位點(diǎn)是固定不變的，常常難以滿足研究的具體需求，盡管稀有酶類，同尾酶的發(fā)現(xiàn)彌補(bǔ)了一些缺陷，整體構(gòu)建的效率沒有質(zhì)的提升[5，21]。

基于位點(diǎn)特異性重組的Gateway 技術(shù)得到越來越多研究人員的青睞，該技術(shù)的應(yīng)用使得外源基因的插入不再受酶切位點(diǎn)的限制，通過兩步重組反應(yīng)就能實(shí)現(xiàn)目的基因的插入，大大提高了載體構(gòu)建效率[6-8，22]。本研究以整合Gateway重組載體的高效構(gòu)建和傳統(tǒng)載體的高效表達(dá)為目的，從研究的角度出發(fā)，展示了一種重組型原核表達(dá)載體的改造方法。該方法同樣適用其他載體系統(tǒng)的改造，但是，在實(shí)際操作時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)：（1）Gateway系列載體核心重組和ccdB序列中包含了很多酶切位點(diǎn)，通過常規(guī)的方法很難將該序列轉(zhuǎn)移到載體的多克隆位點(diǎn)。通過分析，我們選擇了用BamHⅠ和XhoⅠ酶切載體，而用BglⅡ和XhoⅠ酶切重組序列，BamHⅠ和BglⅡ?yàn)橥裁?，酶切之后形成粘性末端可以在T4連接酶的作用下完成連接，從而達(dá)到轉(zhuǎn)移目的。但是一旦連接成功，BamHⅠ和BglⅡ的位點(diǎn)就被破壞，無法通過再次酶切、轉(zhuǎn)移[23];（2）連接后的載體因?yàn)楹衏cdB致死基因，導(dǎo)致一般的DH5α、TOP10菌株無法擴(kuò)繁，需選用特定DB3.1感受態(tài)進(jìn)行擴(kuò)繁[24]。（3）當(dāng)載體完成改造后，必須通過目的基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，主要是因?yàn)橹滤阑騝cdB的序列中含有高級結(jié)構(gòu)，所以無法通過測序來確定讀碼框的正確，一旦在克隆過程中序列出現(xiàn)突變，則會影響到后續(xù)的表達(dá)研究。本研究選取胡椒PnHMGB作為目標(biāo)基因驗(yàn)證載體的構(gòu)建是否準(zhǔn)確，是由該基因序列的特點(diǎn)而定。胡椒PnHMGB序列在蛋白翻譯時(shí)存在3種讀碼可能，分別會翻譯出18、9、6 ku等3種蛋白，但只有翻譯出18 ku大小的蛋白才能說明載體按照正確的讀碼方式翻譯蛋白，從而證明在改造過程中載體本身并沒有發(fā)生突變、移碼的情況。

通過重組序列克隆、轉(zhuǎn)移到目的蛋白表達(dá)驗(yàn)證這一系列的實(shí)驗(yàn)操作，本文展示了一種重組型原核表達(dá)載體的改造方法，該載體的成功構(gòu)建可以保證目標(biāo)片段的插入不再受限于酶切位點(diǎn)的選擇，同時(shí)引入ccdB致死基因的篩選方式大大提高了選擇的效率。該研究為載體改造提供了新的思路，豐富并拓展了Gateway重組技術(shù)的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 張獻(xiàn)龍， 唐克軒. 植物生物技術(shù)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2004.

[2] Sambrook J， Russell D W. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 黃培堂， 黃恒樑， 周曉巍， 等譯. 北京： 科學(xué)出版社， 2002.

[3] Dallas-Yang Q， Jiang G， Sladek F M. Digestion of terminal restriction endonuclease recognition sites on PCR products[J]. Biotechniques， 1998， 24（4）： 582-584.

[4] 牛 ?麟. pTriEx-4neo載體多克隆位點(diǎn)的改造;抗跨膜TNF-α單克隆抗體C1可變區(qū)基因測序及嵌合抗體的構(gòu)建[D]. 武漢： 華中科技大學(xué)， 2009.

[5] 林春晶， 韋正乙， 蔡勤安， 等. 幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J]. 生物技術(shù)， 2008， 18（5）： 84-87.

[6] Hartley J L， Temple G F， Brasch M A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination[J]. Genome Research， 2000， 10（11）： 1 788-1 795.

[7] Katzen F. GatewayR recombinational cloning： a biological operating system[J]. Expert Opinion Drug Discovery， 2007， 2（4）： 571-589.

[8] Karimi M， Depicker A， Hilson P. Recombinational cloning with plant gateway vectors[J]. Plant Physiology， 2007， 145（4）： 1 144-1 154.

[9] Joubès J， De Schutter K， Verkest A， et al. Conditional， recombinase-mediated expression of genes in plant cell cultures[J]. The Plant Journal， 2004， 37（6）： 889-896.

[10] Landy A. Dynamic， structural， and regulatory aspects of lambda site-specific recombination[J]. Annual Review of Biochemistry， 1989， 58（1）： 913-941.

[11] Bushman W， Thompson J F， Vargas L， et al. Control of directionality in lambda site specific recombination[J]. Science （New York， NY）， 1985， 230（4 728）： 906.

[12] Cheo D L， Titus S A， Byrd D R N， et al. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination： functional analysis of multi-segment expression clones[J]. Genome Research， ?2004， 14（10B）： ?2 111-2 120.

[13] Earley K W， Haag J R， Pontes O， et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics[J]. The Plant Journal， 2006， 45（4）： 616-629.

[14] Helliwell C， Waterhouse P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants[J]. Methods， 2003， 30（4）： 289-295.

[15] Lund B A， Leiros H K S， Bjerga G E K. A high-throughput， restriction-free cloning and screening strategy based on ccdB-gene replacement[J]. Microbial Cell Factories， 2014， 13（1）： 38.

[16] 范 ?睿， 凌 ?鵬， 顧文亮， 等. 海南蒟 cDNA 文庫的構(gòu)建及評價(jià)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（4）： 636-640.

[17] 潘求真， 徐曙光， 李 ?佳， 等. 綠色熒光蛋白表達(dá)載體的改造和表達(dá)[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2007（1）： 13-15.

[18] 周 ?紅， 姜良良， 燕 ?飛， 等. 一種無標(biāo)記基因植物表達(dá)載體的改造方法[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 25（4）： 804-807.

[19] 蘇 ?寧， 孫 ?萌， 李軼女， 等. 水稻葉綠體16S啟動子克隆改造、 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化研究[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2003， 20（3）： 295-301.

[20] 李敬濤， 孫新華， 余 ?剛， 等. 幾種基于pCAMBIA系列多用途新型植物表達(dá)載體的改建及優(yōu)化[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)： 理學(xué)版， ?2014， 52（2）： 371-375.

[21] 李 ?磊， 薛 ?薌， 左示敏， 等. 一種改造載體多克隆位點(diǎn)的新方法[J]. 生物技術(shù)， 2013， 23（4）： 40-43.

[22] 肖素勤， 孫 ?振， 軒秀霞， 等. 用于通路（Gateway）克隆技術(shù)的植物表達(dá)載體研究進(jìn)展[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 30（5）： 528-544.

[23] 姚玲玲， 王家寧， 黃永章， 等. 利用同尾酶技術(shù)構(gòu)建pET15b-PEP-1-CAT重組質(zhì)粒[J]. 鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2006， 25（1）： 1-6.

[24] Parr R D， Ball J M. New donor vector for generation of histidine-tagged fusion proteins using the Gateway Cloning System[J]. Plasmid， 2003， 49（2）： 179-183.