銀翹散對呼吸道黏膜免疫功能低下合并甲型流感病毒感染模型小鼠的影響

柳麗松 殷紅等

摘要：目的 觀察銀翹散對呼吸道黏膜免疫功能低下合并流感病毒感染模型小鼠的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 復(fù)制寒冷刺激致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型，采用甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/PR/8/34 （H1N1）通過鼻腔接種方式感染模型小鼠，將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥（利巴韋林）組及銀翹散組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，觀察各組小鼠死亡率、生命延長率、平均存活時(shí)間及肺指數(shù)。結(jié)果 與模型組比較，陽性藥組、銀翹散組小鼠死亡率明顯降低（P<0.05，P<0.01），存活時(shí)間延長；陽性藥組、銀翹散組小鼠肺指數(shù)明顯降低（P<0.05，P<0.01），肺指數(shù)抑制率分別為35.5%、24.6%。結(jié)論 銀翹散通過上調(diào)模型小鼠上呼吸道局部黏膜免疫功能，達(dá)到防治上呼吸道感染的作用。

關(guān)鍵詞：銀翹散；流感；黏膜免疫；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.019

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）08-0070-03

Effects of Yinqiao Powder on Mouse Models with Upper Respiratory Trace Mucosal Immunity Dysfunction Infected with Influenza Virus A LIU Li-song， YIN Hong， WANG Wei-li， YAN Han-wen， LIN Qing， Lei Na （Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

Abstract：Objective To observe the effect of Yinqiao Powder on the mouse models with upper respiratory trace mucosal immunity dysfunction infected with influenza virus A， and explore mechanism of action. Methods The mouse models of upper respiratory trace mucosal immunity dysfunction induced by cold stimulation with the influenza A/PR/8/34 （H1N1） virus through the nasal cavity were established. The mice were randomly divided into normal group， model group， positive medicine （Ribavirin） group， and Yinqiao Powder group. All administration groups received gavage with relevant medicine， and then mortality， the life prolonging rate， average survival time and the lung index of each group were observed. Results Compared with the model group， the mortalities in positive medicine group and Yinqiao Powder group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， with longer survival time. The lung indexes in positive medicine group and Yinqiao Powder group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， and the inhibition ratios of lung index were 35.5% and 24.6%， respectively. Conclusion Yinqiao Powder can realize the protective effects on upper respiratory infection through upregulating the mucosal immunity of the upper respiratory tract of mouse models.

Key word：Yinqiao Powder；influenza；mucosal immunity；mice

基金項(xiàng)目：國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科-培育學(xué)科（2012年）；云南省優(yōu)勢特色重點(diǎn)學(xué)科（群）建設(shè)項(xiàng)目（2011-2015年）；云南省科技計(jì)劃青年項(xiàng)目（2013FD035）；云南白藥、云南中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥教育創(chuàng)新基金項(xiàng)目（YB2014Y02）

通訊作者：雷娜，E-mail：492078820@qq.com

急性上呼吸道感染（以下簡稱“上感”）是臨床常見的呼吸道傳染病，70%～80%由病毒感染引起，僅少部分由細(xì)菌感染引起，病毒感染后亦可繼發(fā)細(xì)菌感染，且易引起支氣管炎及肺炎。采取抗病毒、抗菌的對因治療及解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎的對癥治療是治療上感的主要方法，但由于目前用于上感治療的抗病毒藥物

僅對一種或幾種病毒有效，加之病毒具有亞型多樣性及快速變異性的特點(diǎn)，導(dǎo)致藥物對因治療的困難，非甾體類抗炎藥物僅限于改善臨床癥狀。因此，積極尋找防治上感的有效藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。前期研究表明，解表方銀翹散能提高模型小鼠呼吸道黏膜免疫功能[1]。本研究采用鼻腔接種甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/PR/8/34（H1N1）感染呼吸道黏膜免疫功能低下小鼠模型，觀察銀翹散的體內(nèi)抗流感病毒的作用，并探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

ICR小鼠，SPF級，5周齡，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK（京）2009-0004，飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學(xué)院SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物、主要試劑與儀器

按《方劑學(xué)》[2]銀翹散的組成（連翹30 g，金銀花30 g，桔梗18 g，薄荷18 g，牛蒡子18 g，淡竹葉12 g，甘草15 g，荊芥穗12 g，淡豆豉15 g），飲片均購自昆明一心堂大藥房；利巴韋林片，江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號1302009。按人和動(dòng)物的體表面積計(jì)算法[3]，根據(jù)臨床藥量換算出小鼠銀翹散用量為21.84 g/kg利巴韋林用量為0.15 g/kg，給藥體積均為0.2 mL/10 g。乙醚，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司，批號101030；-80 ℃超低溫冰箱，美國Thermo公司；-20 ℃冰箱，伊萊克斯公司。

1.3 病毒株

甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/PR/8/34（H1N1），四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心提供，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用—x±s表示，組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 上呼吸道黏膜免疫功能低下模型小鼠半數(shù)致死量測定

取凍存流感病毒液，復(fù)融后用生理鹽水10倍連續(xù)稀釋為10-1～10-66個(gè)濃度組備用，正常組給予生理鹽水。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為7組，雌雄各半，每組10只。復(fù)制上呼吸道黏膜免疫功能低下模型[1]，室溫下適應(yīng)30 min，乙醚輕度麻醉，用移液槍經(jīng)小鼠鼻腔接種10-1～10-6流感病毒液，0.05 mL/只，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠死亡數(shù)，按Reed-Muench法[2]計(jì)算流感病毒對小鼠的半數(shù)致死量（LD50）。測得本室保存的甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株H1N1感染小鼠的LD50值為3.33。將病毒液做10-3.33稀釋接種，可引起50%小鼠死亡，見表1。

2.3 銀翹散對黏膜免疫功能低下合并流感病毒感染模型小鼠的影響

將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組及銀翹散組，每組20只。復(fù)制寒冷刺激致上呼吸道黏膜免疫功能低下小鼠模型[1]，小鼠室溫下適應(yīng)30 min，采用乙醚輕度麻醉小鼠，用移液槍經(jīng)小鼠鼻腔接種引起小鼠LD50濃度流感病毒0.05 mL/只，陽性藥（利巴韋林）組及銀翹散組在滴鼻感染流感病毒前2 d開始給藥，感染后1 h再給藥1次，連續(xù)5 d，1次/d，記錄14 d各組小鼠死亡數(shù)和平均存活時(shí)間及生命延長率。結(jié)果表明，與正常組比較，流感病毒感染模型小鼠死亡率為60%，陽性藥組、銀翹散組小鼠死亡率分別為15%、25%（P<0.05，P<0.01），延長模型小鼠平均生存時(shí)間，見表2。

（下同）

2.4 銀翹散對黏膜免疫功能低下合并流感病毒感染模型小鼠肺指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥、造模及接種病毒方法同“2.3”項(xiàng)，小鼠于感染后第6日稱重后摘眼球放血處死，取全肺稱重，計(jì)算肺指數(shù)（全肺質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%）及肺指數(shù)抑制率[（模型組平均肺指數(shù)-給藥組平均肺指數(shù)）÷模型組平均肺指數(shù)×100%]。結(jié)果表明，利巴韋林、銀翹散均能抑制模型小鼠肺指數(shù)（P<0.05，P<0.01），肺指數(shù)抑制率分別為35.5%、24.6%。銀翹散組與陽性藥組比較無明顯差異，見表3。

3 討論

辨證論治是中醫(yī)理論的核心，是中醫(yī)臨床診斷、治療疾病的基本原則。臨床實(shí)踐中，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，對由癥狀組成的證候進(jìn)行證的分辨確認(rèn)，從而立法、選方、遣藥對疾病進(jìn)行治療。惡寒、發(fā)熱、鼻塞、噴嚏、流鼻涕、咳嗽、咽喉癢痛等是上感的主要癥狀，這些與中醫(yī)表證的癥狀極其相似，中醫(yī)往往將其歸于表證的范疇進(jìn)行辨證治療[4]。根據(jù)辨證不同分別采用辛溫解表的麻黃湯、辛涼解表的銀翹散等解表方進(jìn)行治療，其中銀翹散是臨床上防治上感使用最為廣泛、療效較好的方劑[5-6]。但已有的對其防治上感的機(jī)制研究主要集中于解熱、抗炎、抗病原體等方面[7]，其藥效與化學(xué)藥物相比并未表現(xiàn)出優(yōu)勢，難以解釋其對上感良好的臨床療效。

為探究解表方防治上感的機(jī)制，本課題組前期基于呼吸道黏膜免疫功能低下是發(fā)生上感的重要條件的事實(shí)，建立了寒冷致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型[1]，表明銀翹散能提高模型小鼠上呼吸道黏膜免疫功能，對上呼吸道黏膜免疫功能低下合并鼻腔接種肺炎鏈球菌小鼠有生存保護(hù)作用，但對腹腔感染肺炎鏈球菌的模型無保護(hù)作用，也無體外抗菌作用。因此，我們認(rèn)為銀翹散可能是通過上調(diào)模型小鼠上呼吸道局部黏膜免疫功能，達(dá)到防治上感的作用[7]。由于上感主要由病毒感染引起，因此，本實(shí)驗(yàn)在寒冷致小鼠呼吸道黏膜免疫功能低下的模型基礎(chǔ)上，采用鼻腔接種H1N1感染小鼠，觀察銀翹散體內(nèi)抗流感病毒的作用，為進(jìn)一步研究銀翹散藥防治上感的確切作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

死亡率是一種表示宿主易感性及藥物對病毒感染宿主的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，可從整體水平反映藥效；對病毒感染動(dòng)物生存的保護(hù)，包含藥物對病毒增殖的抑制作用，也涉及藥物對病毒感染機(jī)體的保護(hù)及對相應(yīng)毒素的對抗作用。因此，動(dòng)物的生存保護(hù)作用是研究中藥抗病毒作用的常用指標(biāo)。流感病毒感染后期常引起病毒性肺炎，因此，肺指數(shù)可作為流感病毒感染情況的指標(biāo)[8]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，銀翹散對黏膜免疫功能低下合并鼻腔接種流感病毒小鼠有生存保護(hù)作用，能夠降低模型小鼠死亡率、延長其生存時(shí)間、抑制肺指數(shù)。結(jié)合前期研究，銀翹散不僅對黏膜免疫功能低下模型小鼠合并細(xì)菌感染有效，對黏膜免疫功能低下模型小鼠合并病毒感染也有效。因此，不能僅以抗病毒或抗菌解釋其臨床防治上感的作用。本研究結(jié)果表明，銀翹散防治上感的作用與提高上呼吸道黏膜免疫功能有關(guān)。

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（收稿日期：2015-02-09）

（修回日期：2015-02-26；編輯：華強(qiáng)）