反膠束水合萃取技術(shù)在生物工程領(lǐng)域的研究進(jìn)展

蘭宇 孫向東 趙冬梅

摘要 介紹了反膠束的基本概念和反膠束萃取技術(shù)在國(guó)內(nèi)外的最新研究動(dòng)態(tài)，綜述了反膠束水合萃取技術(shù)的反應(yīng)機(jī)理及其在生物工程中的應(yīng)用研究進(jìn)展，并對(duì)其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：反膠束；水合；生物工程

中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）08-004-03

近年來(lái)，科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，使得人們對(duì)環(huán)保的意識(shí)逐漸增強(qiáng)，而對(duì)新能源的開發(fā)利用及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用擴(kuò)展，促使水合物分離技術(shù)的應(yīng)用研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視，許多發(fā)達(dá)國(guó)家也將水合物的形成及分離技術(shù)視為具有很大發(fā)展前景的新興技術(shù)，并將其作為主要進(jìn)軍領(lǐng)域。水合物技術(shù)對(duì)低溫溶液特別有效，且水合形成消耗反膠束內(nèi)部分自由水的同時(shí)可以減小反膠束大小，使得其中的酶活性產(chǎn)生變化。水合物技術(shù)對(duì)反萃取的進(jìn)程還具有催化作用，一般會(huì)把它運(yùn)用在反膠束體系中生物酶活性的控制以及萃取。反膠束萃取技術(shù)與堿提酸沉方法相比應(yīng)用潛力更為廣泛，具有萃取率高，溶劑可循環(huán)使用，反應(yīng)條件溫和，對(duì)人體無(wú)毒，經(jīng)濟(jì)，易于操作等優(yōu)點(diǎn)。反膠團(tuán)的庇護(hù)功能下形成一道屏障，避免蛋白質(zhì)與有機(jī)溶液之間的接觸反應(yīng)，維持生物活性物質(zhì)的固有活性，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的溶解和分離[1]。反膠束水合萃取技術(shù)即反膠束萃取技術(shù)與水合物生成技術(shù)相結(jié)合的一種分離技術(shù)，具有良好的發(fā)展空間，能夠高效地控制和提取生物活性物質(zhì)且易與反膠束溶液分離。

筆者介紹了反膠束萃取技術(shù)的基本概念及其在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，并對(duì)水合物技術(shù)在反膠束體系中的作用機(jī)理和應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述，展望其在未來(lái)的發(fā)展前景。

1 反膠束萃取技術(shù)的理論基礎(chǔ)

1.1 反膠束的基本概念 反膠束萃取技術(shù)作為一種新興的物質(zhì)分離技術(shù)，既適用于分離非極性體系中的極性化合物，也適用于酶的固定化，可廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的提取。

當(dāng)表面活性劑與有機(jī)溶劑混合在一起，且其濃度相對(duì)于臨界膠團(tuán)的濃度較大時(shí)，有機(jī)相中便會(huì)自然地聚集在一起匯成納米級(jí)聚集體即反膠束體系，且這種納米聚集體具有透明、熱力學(xué)穩(wěn)定等特性，其中的極性頭向內(nèi)，非極性尾則向外，形成的親水內(nèi)核，謂之“水池”（圖1），它可以增強(qiáng)溶解蛋白質(zhì)以及氨基酸等極性物質(zhì)的作用[2]，同時(shí)酶也可以被固定在反膠束的“水池”中進(jìn)行催化反應(yīng)。而表面活性劑的分子層能夠阻止極性物質(zhì)接觸有機(jī)溶劑，保持被提取物質(zhì)的活性。

反膠束體系的性質(zhì)常用參數(shù)W0表示，W0表示含水量（mol/L）與表面活性劑的量（mol/L）的比值，如式（1）所示，一般W0越大，有機(jī)相形成反膠束微粒的直徑越大。W0是反映反膠束中含水量多少的一個(gè)重要參數(shù)，在可形成反膠束的濃度范圍內(nèi)，隨著W0增加，更多的水與表面活性劑形成結(jié)合水從而提升萃取率。陽(yáng)離子型以及非離子型，這兩者表面活性劑所形成的反膠束溶液的增溶水量都比陰離子型的小，而非離子型的則比兩性離子型的增溶水量小[3]。

W0 =反膠束增溶水分的物質(zhì)的量濃度（mol/L）反膠束溶液中表面活性劑的物質(zhì)的量濃度（mol/L）×100%（1）

1.2 反膠束的萃取原理及特點(diǎn) 極性物質(zhì)滲入反膠束溶液的過(guò)程是由多種作用相互協(xié)助產(chǎn)生的，即在宏觀兩相界面之間的表面活性劑層，和相鄰的極性物質(zhì)分子產(chǎn)生靜電引力，導(dǎo)致形變，從而界面之間產(chǎn)生擁有這個(gè)極性物質(zhì)的反膠束，繼而分散到有機(jī)相中，以此達(dá)到極性物質(zhì)的萃取（圖2a）。這一過(guò)程稱為前萃??；通過(guò)改變條件使極性物質(zhì)從反膠束轉(zhuǎn)移到水相中，從而分離出此物質(zhì)，即為后萃?。▓D2b）。

反膠束“水池”增溶蛋白質(zhì)等極性物質(zhì)的驅(qū)動(dòng)力，主要包括疏水力、二硫鍵作用力、離子作用力、靜電作用力以及羥基間的相互作用力等，這些作用力都可能使極性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，從而對(duì)萃取率產(chǎn)生重要影響。所以，任何能夠影響這些應(yīng)用的因素，都會(huì)改變蛋白質(zhì)的萃取效果。而這些影響因素主要有反膠束的尺寸、表面活性劑的種類、pH、離子濃度、蛋白質(zhì)電荷量及有增容水量等[4-7]。

2 反膠萃取技術(shù)在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 反膠束萃取蛋白質(zhì)

2.1.1 蛋白質(zhì)混合物分離。

蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量較為接近，可根據(jù)等電點(diǎn)不同或另外等原因所導(dǎo)致溶解度之間存在差異，采用反膠束溶液對(duì)其進(jìn)行選擇性的提取。

Aires-Barros等[8]采用AOT/異辛烷反膠束體系從黏稠色桿菌中分離純化出2種不同等電點(diǎn)的脂酶——脂酶A和脂酶B，脂酶A的分子質(zhì)量是1.2×105 Da，等電點(diǎn)為3.7，脂酶B的分子質(zhì)量是3×104 Da，等電點(diǎn)為7.3。萃取率分別達(dá)到86%和75%。從研究的成效可以看出，反膠束法運(yùn)用在分子質(zhì)量接近的蛋白質(zhì)分離中有較好的應(yīng)用前景。

2.1.2 蛋白質(zhì)和油脂同時(shí)分離。

油脂工業(yè)通常采用先浸油再分離蛋白的工藝分別提取植物油和蛋白，而利用反膠束法可同時(shí)分離油脂和蛋白質(zhì)。李飛等[9]采用AOT/異辛烷反膠束體系同時(shí)提取玉米胚芽油脂和蛋白質(zhì)，通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究了前萃取和后萃取過(guò)程中的主要因素對(duì)油脂和蛋白質(zhì)提取率的影響，得到了最佳萃取工藝條件。通過(guò)反膠束法、浸出法、水酶法3種方法得到玉米胚芽蛋白，并對(duì)其同時(shí)所得油脂的性質(zhì)進(jìn)行分析對(duì)比，結(jié)果表明，以反膠束法萃取的油脂最優(yōu)。堿提酸沉法（16.63%）和水酶法（22.01%）的蛋白質(zhì)提取率略低于反膠束法（28.23%），而純度方面反膠束法提取的蛋白質(zhì)純度（96.21%）較堿提酸沉法（72.97%）和水酶法（12.94%）優(yōu)勢(shì)更加明顯。

2.1.3 發(fā)酵液中酶分離和提純。

從發(fā)酵液中分離和提純酶一直是生物工程領(lǐng)域研究重點(diǎn)之一，國(guó)外學(xué)者已利用反膠束技術(shù)成功地從發(fā)酵液中分離出某些高純度酶。Cocotle-Ronzon等[10]利用CTAB/異辛烷反膠束溶液從木糖醇菌株——熱帶假絲酵母菌IEC5-ITV中分離純化出木糖還原酶，得到8.1倍的純化因子，回收率達(dá)到100%。研究結(jié)果為深入研究其穩(wěn)定性及動(dòng)態(tài)變化奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.2 氨基酸及維生素等功能性添加劑萃取 將反膠束技術(shù)運(yùn)用在氨基酸等添加劑的萃取方面具有很大的應(yīng)用潛力，其中氨基酸等添加劑通過(guò)帶電離子的方式被提取。相同種類的氨基酸在電離形式不同的情況下，所被萃取的實(shí)際值之間同樣存在差距，而結(jié)構(gòu)上具有差異的氨基酸在反膠束中分布的位置也截然不同。因此，根據(jù)氨基酸和反膠束作用之間的差異，來(lái)篩選出所需氨基酸。

王運(yùn)東等[11]使用Pluronic型和R型2種Pluronic嵌段聚合物（由德國(guó)巴斯夫公司生產(chǎn)的），利用聚合物反膠團(tuán)萃取氨基酸（L-苯丙氨酸和L- 異亮氨酸），結(jié)果顯示，通過(guò)對(duì)比它與有機(jī)溶劑的物理萃取氨基酸的平衡時(shí)間，發(fā)現(xiàn)兩者之間相差甚小，而溶質(zhì)處于反膠團(tuán)表層的平衡分配系數(shù)K值一般較高，在它的水池內(nèi)也是如此，在氨基酸水溶液的pH處于等電點(diǎn)附近時(shí)會(huì)使萃取率最大化。依此判斷，聚合物反膠團(tuán)在萃取兩親性質(zhì)的氨基酸的過(guò)程中，增溶作用的關(guān)鍵在其表層位置，涵蓋在聚氧丙烯的外殼或者環(huán)繞聚氧丙烯鏈間的可能性較大。而親油性以及氫鍵則為其萃取注入關(guān)鍵促進(jìn)力。

2.3 抗生素萃取 工業(yè)上采用液-液萃取法生產(chǎn)抗生素已經(jīng)非常普遍。最近研究指出，反膠束溶液不僅可用于萃取以及分離抗生素，且在糖肽類抗生素的應(yīng)用上發(fā)展?jié)摿^大。Mohd-Setapar等[12]研究發(fā)現(xiàn)青霉素G與AOT相互作用時(shí)可作為一種界面活性復(fù)合物質(zhì)，能有效提高提取效率。同時(shí)指出青霉素G的濃度、pH、表面活性劑濃度、水相中鹽的種類和濃度等因素對(duì)反應(yīng)起著重要作用。Hu等[13]利用AOT/異辛烷反膠束體系從丙烯酰胺中同時(shí)提取出新霉素和慶大霉素，并對(duì)影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究，得出最佳萃取條件，萃取后產(chǎn)品純度高達(dá)90%以上。

2.4 核酸萃取 反膠束溶液的運(yùn)用不僅能夠解決核酸較難溶于有機(jī)相中的問(wèn)題，還使得核酸能夠維持其原有的結(jié)構(gòu)特征，這些特點(diǎn)為反膠束法能夠成功從部分噬菌體或者染色質(zhì)中萃取出核酸發(fā)揮了重要作用。Goto等[14]成功采用CTAB/異辛烷反膠束溶液從鮭魚睪丸中提取DNA，結(jié)果表明，萃取的驅(qū)動(dòng)力是陽(yáng)離子表面活性劑和帶負(fù)電荷的DNA之間產(chǎn)生的靜電作用及表面活性劑的疏水性，指出表面活性劑濃度、萃取時(shí)間、pH、鹽濃度在DNA萃取過(guò)程中發(fā)揮重要作用，結(jié)果證明反膠束不僅可以萃取大量的蛋白質(zhì)，且可以有效分離出DNA。

2.5 多糖類物質(zhì)萃取 對(duì)于一些分子量很大的物質(zhì)（>10kDa），由于其分子半徑大，不易被萃取進(jìn)反膠束內(nèi)核，采用反膠束體系萃取多糖類等高分子量物質(zhì)的研究較少，有關(guān)學(xué)者尚在進(jìn)行探索性研究。曹學(xué)軍等運(yùn)用AOT/正庚烷，研究了茶多糖大分子物質(zhì)的萃取以及反萃取過(guò)程中的主要影響因素，使萃取條件得到了明顯改善。研究表明，將多糖萃取到反膠束的同時(shí)使反萃取率提升至2倍以上，使反膠束技術(shù)能夠萃取大分子物質(zhì)成為了可能 [15]。

3 反膠束水合萃取

3.1 反膠束水合萃取機(jī)理 水合物即為氣-液的非均相中反應(yīng)階段結(jié)晶的產(chǎn)物，之后在液相中析出[16]，反應(yīng)如式（2）所示：

M（g）+nwH2O（l）→M·nwH2O（s）（2）

反膠束水合萃取機(jī)理是水合物的生成調(diào)節(jié)了反膠束中含水量，然后在水池里形成核，這個(gè)過(guò)程也使束內(nèi)的一些自由水發(fā)生變化，即在反膠束內(nèi)的水合物晶體的濃度比有機(jī)溶劑高的條件下，由于反膠束在體系中反應(yīng)的過(guò)程，會(huì)一直出現(xiàn)分離和重新結(jié)合的現(xiàn)象，此時(shí)水合物的晶核和晶體便會(huì)流出，而部分自由水也就是以晶體的狀態(tài)轉(zhuǎn)移出的，伴隨晶體沉降這一進(jìn)程的持續(xù)進(jìn)行，束內(nèi)水量持續(xù)減少，從而使得含水量以產(chǎn)生水合物的形式實(shí)現(xiàn)了調(diào)節(jié)[17]。利用靜電或疏水作用，部分極性物質(zhì)在水池里也可實(shí)現(xiàn)增溶，同時(shí)與水合物的形成過(guò)程同步，析出于反膠束中，使萃取更為顯著，這種現(xiàn)象即是界面控制，且其主要影響因素有水相鹽度、酸度以及壓力等。

3.2 反膠束水合萃取技術(shù)的應(yīng)用 Nguyen等[18]研究了在熱力學(xué)條件下籠形水合物在反膠束中生成過(guò)程，及在生成過(guò)程中的主要影響因素為水與表面活性劑摩爾比W0，研究表明W0在10～15時(shí)萃取出的酶活性最高，探討了反膠束水合萃取的調(diào)節(jié)機(jī)理和氨基酸的提取機(jī)理即水合物形成使反膠束的尺寸發(fā)生改變，從而調(diào)節(jié)了反膠束中水池含水量，增溶氨基酸的能力也隨之受到影響；Noritomi等[19]采用AOT/異辛烷—丙烷，CFM，TFE體系從牛胰腺中水合萃取細(xì)胞色素C和核糖核酸酶A，萃取率高達(dá)80%。該研究不需要考慮pH和離子強(qiáng)度的變化，且因TFE的添加，使萃取出細(xì)胞色素C可以恢復(fù)其固有活性；丁皓等[20]采用CTAB/正辛烷-正戊醇反膠束體系萃取螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白，對(duì)萃取效果及純化效果進(jìn)行了研究，并分析了水合萃取的溫度、壓力、CTAB濃度、含水量W0等因素對(duì)反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白的作用，確定了最佳工藝參數(shù)，即初始條件為3 ℃、4 MPa、CTAB濃度0.10 mol/L、W0 40%時(shí)，藻藍(lán)蛋白的萃取效果最佳，萃取率提至81.3%。這為進(jìn)一步開展反膠束水合萃取技術(shù)的研究及水合物法保護(hù)生物物質(zhì)活性提供了有益的參考。

4 展望

新興的反膠束水合萃取工藝，拓寬了生物分離技術(shù)的發(fā)展領(lǐng)域，并取得了明顯的成就。水合物的形成是萃取過(guò)程中控制和提取束內(nèi)生物活性物質(zhì)的關(guān)鍵。通過(guò)將反膠束技術(shù)和水合物技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，不僅可以避免蛋白質(zhì)等極性物質(zhì)變性問(wèn)題，且反膠束溶液可反復(fù)利用，萃取過(guò)程可連續(xù)操作、處理量大，試劑無(wú)毒，對(duì)人體沒(méi)有傷害，耗費(fèi)成本低，在工業(yè)化生產(chǎn)方面顯示了很大的應(yīng)用潛力。盡管這一技術(shù)目前仍處于探索性研究開發(fā)階段，無(wú)論在機(jī)理還是應(yīng)用方面均需要深入研究，如反膠束水合萃取的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)研究尚不夠深入細(xì)致，萃取后的生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化及其對(duì)功能性影響還不明確等，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，反膠束水和萃取技術(shù)在生物工程領(lǐng)域潛力巨大，雖然還有許多實(shí)際問(wèn)題需要解決，但應(yīng)用前景廣闊。

參考文獻(xiàn)

[1] 王永濤，趙國(guó)群，張桂.反膠束萃取技術(shù)及其在食品中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（7）：171-173.

[2] 楊穎瑩，陳復(fù)生，布冠好，等.反膠束萃取技術(shù)及其在食品科學(xué)中應(yīng)用[J].糧食與油脂，2012（1）：1-3.

[3] 郭曉歌，趙俊廷.不同反膠束體系增溶水的比較[J].精細(xì)石油化工進(jìn)展，2008，9（2）：22-24.

[4] 高艷秀，陳復(fù)生，郭珍，等.不同反膠束體系超聲提取花生蛋白的研究[J].食品工業(yè)，2013，34（5）：46-50.

[5] 劉海遠(yuǎn)，陳復(fù)生，布冠好，等.反膠束技術(shù)及其萃取蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2010，（11）：231-233.

[6] 郭 珍，陳復(fù)生，高艷秀，等.反膠束后萃蛋白質(zhì)研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2012，28（5）：231-233.

[7] 趙曉燕，薛文通，陳復(fù)生，等.影響反膠束體系萃取蛋白能力的因素及機(jī)理[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25（11）：354-360.

[8] AIRES-BARROS M R，CABRAL J M S.Selective separation and purification of two lipases from chromobacterium viscosum using AOT reversed micelles[J].Biotechnology and Bioengineering，1991，38：1302-1307.

[9] 李飛，朱科學(xué)，周惠明，等.反膠束法同時(shí)提取玉米胚芽中蛋白質(zhì)和油脂的前萃工藝研究[J].中國(guó)油脂，2009，34（11）：27-30.

[10] COCOTLE-RONZON Y，ZENDEJAS-ZALDO M，CASTILLO-LOZANO M L，et al.Preliminary characterization of xylose reductase partially purified by reversed micelles from candida tropicalis IEC5-ITV，an indigenous xylitol-producing strain[J].Advances in Chemical Engineering and Science，2012，2：9-14.

[11] 王運(yùn)東，施長(zhǎng)云，CAN Q，等.聚合物反膠團(tuán)萃取氨基酸的研究[J].糧食與油脂，2002，34（5）：75-79.

[12] MOHD-SETAPAR S H，WAKEMAN R J，TARLETON E S.Penicillin G solubilisation into AOT reverse micelles[J].Chemical Engineering Research and Design，2009，87：833-842.

[13] HU Z，GULARI E.Extraction of aminoglycoside antibiotics with reverse micelles[J].J Chem Tech Biotechnol，1996，65：45-48.

[14] GOTO M，ONO T，HORIUCHI A，et al.Extraction of DNA by Reversed Micelles[J].Journal of Chemical Engineering of Japan，1999，32（1）：123-125.

[15] 李松麗.反膠束技術(shù)萃取茶多糖[D].廣州：華南理工大學(xué)，2012：1-55.

[16] 董樹杰.氨基酸的反膠束水合萃取研究[D].杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2007：1-67.

[17] 賀亞.水合物在反膠束體系中的生成特性及反膠束含水量的影響機(jī)制，2005：1-62.

[18] NGUYEN H，PHILLIPS J B，JOHN V J.Clathrate Hydrate Formation in Reversed Micellar Solutions[J].The Journal of Physical Chemistry，1989，93（25）：8123-8126.

[19] NORITOMI H，HIDAKA Y，KATO S，et al.Recovery of protein from reverse micelles through gas hydrate formation[J].Biotechnology Techniques，1999，13：181-183.

[20] 丁皓，裘俊紅.反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39（4）：372-375.