廣西壯族人群散發(fā)性帕金森病PARK2和LRRK2基因的多態(tài)性

龐國防 梁慶華 呂澤平 胡才友 黃東挺 周博峰 黃春麗 余天智 唐鳳川 潘尚領 彭均華

(廣西自壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院神經(jīng)內科，廣西 南寧 530021)

5%～10%的帕金森病(PD)患者表現(xiàn)為常染色體顯性或隱性遺傳，因此，對遺傳易感基因的篩查成為近期研究PD的熱點之一〔1〕。歐洲、美洲人群及日本等東亞主要群體的病例-對照研究及全基因組關聯(lián)分析結果顯示，帕金森病蛋白(PARK)2和富亮氨酸重復激酶(LRRK)2基因的一些單核苷酸多態(tài)性(SNP)分別在常染色體隱性早發(fā)(50歲前發(fā)病)及常染色體顯性晚發(fā)(50歲后發(fā)病)PD的發(fā)病中可能扮演重要的角色，而且呈現(xiàn)明顯的群體及地域特異性〔2～4〕。至今 PARK2及 LRRK2基因已發(fā)現(xiàn)約150個 SNPs與PD關聯(lián)〔2〕，其中部分 SNP已在沈陽、江蘇、湖南等地區(qū)的漢族人群中得到重現(xiàn)〔5～7〕。羅曙光等〔8〕也發(fā)現(xiàn)該基因第10外顯子的V380L多態(tài)性與廣西地區(qū)漢族女性PD的遺傳易感性有關。但至今，壯族群體PD的遺傳流行病學尚無報道。本研究結合東亞人群常見的PD相關基因變異，對廣西壯族散發(fā)性PD患者PARK2及LRRK2基因5個SNP進行基因分型，了解這些基因多態(tài)性與廣西壯族PD發(fā)病的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 (1)PD組:2011年5月至2013年12月我院收治的散發(fā)PD患者，無明顯家族史，共112例，年齡(64.29±12.93)歲，其中男59例，女53例，均為壯族，主要來自南寧及周邊的百色、河池等地區(qū)，并以50歲為界分為早發(fā)及晚發(fā)亞組。均符合1992年英國帕金森病協(xié)會及中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會運動障礙及帕金森病學組制定的診斷標準〔11，12〕，由兩位資深神經(jīng)內科醫(yī)生共同確定診斷。(2)對照組:為來自相同地區(qū)，年齡、民族、性別構成與PD組匹配的健康中老年人156例，年齡(62.85±11.62)歲，男84例，女72例。研究對象除了詳細的神經(jīng)系統(tǒng)檢查外，常規(guī)的體格檢查及身高、體重、血壓等臨床數(shù)據(jù)亦一并采集。研究對象均知情并同意。PD組的飲酒比例、BMI、收縮壓、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)均明顯大于對照組(均P＜0.05)，而吸煙的比例小于對照組(P＜0.05)，兩組性別構成及年齡構成、舒張壓、低密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 所有研究對象禁食12 h后于清晨空腹采肘靜脈血8 ml，其中3 ml ACD抗凝血用于白細胞基因組DNA提取，5 ml非抗凝血分離血清后用于血脂測定。

1.2.2 DNA提取 采用經(jīng)典的酚-氯仿法。

1.2.3 血脂測定 血清TC、TG采用酶法，HDL-C、LDL-C采用酶聯(lián)免疫一步法，試劑盒購自申能試劑公司。

1.2.4 SNP基因分型 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)(PCR-RFLP)進行分型，引物參考文獻〔7～10〕進行設計，由上海生工公司合成。各SNP的基本特征、引物序列、PCR退火溫度、內切酶種類、酶切產物大小等數(shù)據(jù)見表1。PCR反應總體積為20μl，其中2×Taq Master Mix(北京康為世紀生物科技有限公司)10 μl，上、下游引物(0.2 μmol/μl)各1 μl，Taq DNA 聚合酶〔寶生物工程(大連)有限公司〕1 U，基因組 DNA 200 ng(1μl)及ddH2O 7μl。SNP rs1801582的 PCR條件:94℃預變性5 min后，94℃變性 40 s，59℃ 退火 40 s，72℃ 延伸 50 s，35 個循環(huán)，再72℃延伸10 min。取10μl PCR產物加入0.2 U限制性內切酶Bsp1286 I〔寶生物工程(大連)有限公司)，72℃水浴消化4 h，然后取酶切產物8μl在2%瓊脂糖凝膠中80 V電泳30 min。rs1801582的PCR產物為165 bp，酶切產物電泳后僅出現(xiàn)1條帶者(165 bp)為GG野生純合型，出現(xiàn)3條帶型(165，107，58 bp)者為GC雜合突變型，出現(xiàn)2條帶型(107，58 bp)者為CC純合突變型。其余4個SNP的PCR-RFLP體系、條件及帶型特點見表2。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件。本研究中TG為正偏態(tài)資料，對數(shù)轉換后為正態(tài)分布，以中位數(shù)表示，P值均已經(jīng)對數(shù)轉換，其余符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。基因頻率用直接計數(shù)法計算。Hardy-Weiberg平衡采用擬合優(yōu)度χ2檢驗。兩組計量資料的組間比較采用t檢驗，兩組以上比較采用方差分析。分類資料組間比較采用χ2檢驗。

表1 研究對象的基本臨床特征(±s)

表1 研究對象的基本臨床特征(±s)

臨床特征 PD組(n=112)對照組(n=156)P值64.29±12.93 62.85±11.62 0.045性別〔n(%)〕 男 59(52.7) 84(53.8) 0.96女53(47.3) 72(46.2)年齡〔n(%)〕 ≤50歲 42(37.5) 76(48.7) 0.062＞50歲 70(62.5) 80(51.3)吸煙〔n(%)〕 是 29(25.9) 59(37.8) 0.002否83(74.1) 97(62.2)飲酒〔n(%)〕 是 20(17.9) 19(12.2) 0.039否92(82.1) 137(87.8)BMI(kg/m2) 22.51±3.43 21.14±3.17 0.041收縮壓(mmHg) 136.23±28.14 129.45±25.31 0.034舒張壓(mmHg) 87.21±13.65 84.76±12.28 0.056 TC(mmol/L) 5.08±1.01 4.91±0.94 0.038 TG(mmol/L) 0.97(0.49) 0.93(0.47) 0.026 HDL-C(mmol/L) 1.58±0.38 1.62±0.37 0.122 LDL-C(mmol/L)年齡(歲)3.00±0.86 2.82±0.80 0.017

表2 各SNP的基本特征及基因分型策略

2 結果

5個SNP的分布均符合H-W平衡。在PARK基因的多態(tài)位點rs45530340，T等位基因攜帶者罹患PD的風險約為正常人群的2.252倍(95%CI:1.186～3.517，P=0.009)。無論早發(fā)、晚發(fā)或總體，PD組的CT雜合基因型頻率及T等位基因頻率均明顯高于對照組的相應亞組(P＜0.01～0.05)，PD組內的早發(fā)及晚發(fā)亞組基因型頻率及等位基因頻率無明顯差別(P＞0.05)。在LRRK2基因的rs34778348位點，A等位基因攜帶者罹患PD的風險也明顯升高(OR=1.632，95%CI:1.238～2.346)，但 P值稍弱，總體上PD組等位基因A及純合突變型AA的頻率高于對照組(P＜0.05)。另3個SNP的基因型和等位基因頻率分布兩組間無差異(P=0.445～0.894)。見表3。

表3 廣西壯族人群散發(fā)性PD的相關基因及致病基因〔n(%)〕

3 討論

PARK2基因也稱為parkin或E3泛素蛋白連接酶基因，全長超過500 kb，包含12個外顯子。Parkin可催化泛素分子與特異性底物的結合，并通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解這些目標底物〔9〕。早發(fā)性PD患者多數(shù)有PARK2基因的多重突變，而且這些突變會影響PARK2的一個或多個功能區(qū)并導致PARK2的功能改變〔2〕。LRRK2基因位于染色體12q，全長145 kb，包括51個外顯子，編碼含2575個氨基酸的dardarin蛋白(震顫蛋白)，其功能涉及到底物的結合、底物的磷酸化、蛋白-蛋白之間的交互作用等。例如，它直接使絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt1(亦稱蛋白激酶B1)磷酸化而活化Akt1，而后者是生長激素及其受體之間信號轉導的關鍵分子。正常的Akt1磷酸化/去磷酸化是確保神經(jīng)細胞生存及凋亡平衡的重要基礎。LRRK2的錯義突變可導致不同程度的病理過程，例如R1441C、G2019S和I2020T突變明顯減少Akt1的磷酸化，引起神經(jīng)細胞的退行性改變，因此LRRK2被認為是家族性及散發(fā)性PD的重要分子〔11，12〕。

本研究的主要發(fā)現(xiàn)是，在廣西地區(qū)壯族散發(fā)性PD患者中，PARK2 rs45530340(L63V)及LRRK2 rs34778348(G2385R)的頻率明顯高于對照組，攜帶rs45530340 T等位基因及rs34778348 A等位基因的個體患PD的風險是普通人群的2.252倍及1.632倍，但基因型及等位基因頻率在早發(fā)和晚發(fā)PD之間無差異。因此，這兩位點可能是壯族散發(fā)性PD的易感因素之一。此結果與張學偉及Zhou等〔5，6〕報道的西南漢族及沈陽漢族的結果基本一致，而與趙輝等〔7〕報道的淮海地區(qū)漢族有所不同，后者PARK2 rs45530340 T等位基因的頻率雖與本結果類似，但PD組與對照組之間無差異(16.4%vs 20%，P=0.251);而在LRRK2 rs1491942位點，PD組的C等位基因頻率明顯高于對照組(43.4%vs 32.8%，P=0.006)?？梢姡琍D與 PARK2及LRRK2基因的關聯(lián)存在明顯的群體特異性。

一些學者認為，PARK2基因的單堿基突變可導致早發(fā)性PD或是晚發(fā)PD的危險因素〔13〕。Wang等〔14〕在果蠅模型上發(fā)現(xiàn)，過度表達PARK2 R275W突變的個體呈現(xiàn)明顯的多巴胺能神經(jīng)退行性變和線粒體異常，與敲除Parkin基因的果蠅的表現(xiàn)相似，說明PARK2在維持線粒體功能穩(wěn)定性方面起著重要的作用。但PARK2單堿基突變導致PD的病理遺傳學機制尚有待進一步闡明，尤其對于多重雜合突變的個體，因為這些突變可能存在潛在的交互作用〔15〕。本研究中，雖然rs1801582在PD和對照人群中無明顯差異，但卻存在較高的GC雜合基因型頻率，而且PD組PARK2 rs45530340雜合基因型CT的頻率明顯高于對照組，故不排除這兩個雜合變異間的交互作用。

LRRK2被認為是家族性及散發(fā)性PD的重要分子〔6〕。本組病例LRRK2 rs34778348(G2385R)等位基因A攜帶者罹患PD的風險明顯高于普通人群，與中國西南漢族及東亞主要群體的結果類似〔7，16〕。此位點位于LRRK2基因第48外顯子的WD40結構域，使第7153號核苷酸G變成A，相應密碼子GGG變成GGA，編碼同樣的氨基酸Gly，被認為是一種沉默的、中性的點突變，在多個西方群體中沒發(fā)現(xiàn)PD患者與普通對照間的頻率差異〔2〕。本組人群及其他東亞群體PD患者高頻等位基因A的潛在生物學意義尚不清楚，與其他未知的致病突變存在連鎖不平衡可能是其解釋之一。本組病例沒發(fā)現(xiàn)LRRK2 rs7133914(R1398H)的頻率在兩組人群中的差異，與 Chen等〔17〕報道的華南漢族的結果一致，但他們把已報道的其他漢族群體的結果合并后再分析發(fā)現(xiàn)，R1398H有降低PD風險的作用。他們認為，R1398H可能降低了Akt1激酶的活性而發(fā)揮其保護作用。至于其如何降低Akt1激酶的活性，目前還不清楚，可能是因為 R1398H位于 ROCO基序中的 ROC結構域，而ROCO具有鳥嘌呤酶活性，LRRK2負責ROC與無活性的GDP和有活性的GTP之間的切換，即當ROC結構域與GTP與結合時，LRRK2的活性增加，而與GDP結合時，活性降低。更重要的是，LRRK2與GTP或GDP結合主要取決于ROC的功能狀態(tài)〔17〕。本研究沒發(fā)現(xiàn)PARK2 rs1801582(V380L)在病例組及對照組之間的差異，與羅曙光等〔8〕報道的廣西漢族群體的結果有所不同，這可能與兩個研究樣本大小、民族構成不同等有關。

本研究只檢測華人群體常見的與PD關系較為密切的PARK2和LRRK2變異，故不能排除壯族PD患者這兩個基因是否還攜帶其他的變異或存在其他基因重排。

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