辛伐他汀對高脂血癥大鼠胸主動脈壁白介素-2、RANTES和趨化因子受體1表達的影響

張哲瑩 張 楠 高建芝 王淑秀

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院病理教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

高脂血癥是動脈粥樣硬化(AS)的主要危險因素之一。單核細胞黏附于血管壁并進入內皮下形成泡沫細胞是AS發(fā)生的重要事件。單核細胞的遷移主要由趨化因子介導〔1〕。依賴正常T細胞激活表達和分泌的因子RANTES屬于CC型趨化因子，對白有趨化和激活作用，多種細胞類型均可分泌該因子，如內皮細胞、平滑肌細胞、活化的 T細胞、巨噬細胞和血小板〔2～4〕。趨化因子的作用均與其相應受體的表達密切相關，其生物活性由靶細胞表面相應的受體介導。CC型趨化因子的受體中，趨化因子受體1(CCR1)和 RANTES的親和力較高〔5〕。對于高脂血癥能否誘導AS病灶平滑肌細胞表達較高水平的RANTES及CCR1，國內外尚無相關報道。白介素-2(IL-2)主要由T細胞產生。IL-2可以增強CC型趨化因子RANTES、MIP-1α及其受體CCR-1的表達，促進炎癥的發(fā)生〔6〕，但在高脂血癥形成AS過程中IL-2是否也起著重要作用還不清楚。本文我們觀察AS病灶中IL-2、RANTES和CCR-1的表達情況及辛伐他汀對其表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 清潔級健康雄性SD大鼠30只，體重(200±20)g，由河南省實驗動物中心提供(合格證號:SC3K豫2005-0001)。IL-2兔抗鼠多克隆抗體(工作濃度1∶200)、RANTES(工作濃度1∶100)兔抗鼠多克隆抗體、CCR-1(工作濃度1∶100)兔抗鼠多克隆抗體、即用型免疫組化試劑盒SA-1022、DAB顯色劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。其他試劑均為國產分析純。Trizol RNA提取試劑盒購自美國Promega公司，RT-PCR試劑盒及PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 實驗分組 30只SD大鼠隨機分為對照組、高脂飲食組和辛伐他汀組，每組10只。對照組用普通飼料喂養(yǎng);高脂飲食組用高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料成分:普通飼料65%，豬油12%，蔗糖5%，奶粉5%，雞蛋10%，麻油1%，食鹽2%)。辛伐他汀組在采用高脂飲食組飼料喂養(yǎng)4 w后，每天以5 mg/kg的辛伐他汀灌胃，并繼續(xù)給予高脂飲食組飼料。

1.3 HE染色 動物心臟取血后，迅速取其胸主動脈約1 cm立即投入新鮮配置的中性福爾馬林固定液中固定24 h。脫水，透明，浸蠟，包埋，并貼上相應組的標簽。所有蠟塊連續(xù)切片(厚度4μm)，HE染色后觀察主動脈病理形態(tài)學變化。

1.4 免疫組織化學染色 按照試劑說明書進行染色。陰性對照組以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，其余步驟相同。RANTES和CCR1蛋白表達陽性結果均為細胞質內出現粗細不均的棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片在200倍光學顯微鏡下隨機選取3個視野測RANTES、CCR1的平均灰度值。

1.5 RT-PCR檢測 應用TRIzol試劑提取血管平滑肌組織總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄和PCR擴增。RANTES引物序列:正鏈為 5’CATCCCTCACCGTCATC 3’，負鏈為5’GCTCATCTCCAAATAGTTG 3’，PCR 擴 增 產 物 長 度 為257 bp。CCR1引物序列:正鏈為5’GGGAGTTCACTCACCATACCTGTAG 3’，負鏈為 5’GGTCCAGAGGAGGAAGAATAGAAG 3’，PCR擴增產物長度為223 bp。IL-2引物序列:正鏈為5＇TTGCACTGACGCTTGTCCTCCTTGTCAACA 3＇，負鏈為 5＇CCATCTCCTCAGAAATTCCACCACAGTTGC 3＇，PCR擴增產物長度為398 bp。內參β-actin引物序列:正鏈為 5’CTTTTGTGCCTTGATAGTTC3’，負鏈為 5’GAGTCCTTCTGACCCATAC 3’，PCR 擴增產物長度為265 bp。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下攝片，用Syngene公司圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，以各組目的基因與β-actin基因擴增條帶積分吸光度值的比值作為各指標mRNA相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析及兩兩比較SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 大鼠血脂濃度 高脂飲食組大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量明顯高于對照組和辛伐他汀組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清TC和TG比較(n=10，x±s，mmol/L)

2.2 HE染色顯示 對照組胸主動脈內膜光滑，內皮細胞排列整齊。高脂飲食組局部可見大鼠主動脈內膜損傷，內皮細胞壞死脫落，中膜平滑肌細胞排列紊亂，內膜下可見泡沫細胞(圖1)。辛伐他汀組介于對照組和高脂飲食組之間。

圖1 SD大鼠胸主動脈病理組織學觀察(HE，×400)

2.3 大鼠主動脈壁細胞RANTES蛋白表達 RANTES蛋白的陽性表達呈粗細不均勻的棕黃色顆粒，局限于細胞質。RANTES蛋白在高脂飲食組表達較強，顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀組(P＜0.05)(表2，圖2)。

表2 各組大鼠胸主動脈壁RANTES、CCR-1和IL-2蛋白表達(平均灰度值，x±s，n=10)

圖2 SD大鼠胸主動脈壁RANTES蛋白的表達(SABC，×400)

2.4 大鼠主動脈壁細胞CCR1蛋白表達 CCR1蛋白的陽性表達呈粗細不均的棕黃色顆粒，局限于細胞質。CCR1蛋白在高脂飲食組的表達顯著高于正常對照組(P＜0.01)和辛伐他汀治療組(P＜0.05)(表2，圖3)。

2.5 大鼠主動脈壁細胞IL-2蛋白表達 IL-2蛋白陽性染色為細胞質或細胞膜出現棕黃色顆粒。IL-2蛋白在高脂飲食組的表達顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀組(P＜0.05)(表2，圖4)。

圖3 SD大鼠胸主動脈壁CCR-1蛋白的表達(SABC，×400)

圖4 SD大鼠胸主動脈壁IL-2蛋白的表達(SABC，×400)

2.6 大鼠動脈壁中RANTES mRNA表達 RANTESmRNA在高脂飲食組的表達顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀組(P＜0.05)(表3，圖5)。

表3 各組大鼠主動脈壁中RANTES、CCR-1和IL-2 mRNA的表達(吸光度值，x±s，n=10)

圖5 各組大鼠動脈壁IL-2 mRNA表達

2.7 大鼠動脈壁細胞CCR1 mRNA表達 CCR1 mRNA在高脂飲食組的表達顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀各組組(P＜0.05)(表3，圖6)。

圖6 各組大鼠主動脈壁RANTES表達

2.8 大鼠動脈壁細胞IL-2 mRNA表達 IL-2 mRNA在高脂飲食組的表達顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀組(P＜0.05)(表3，圖7)。

圖7 CCR1 RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

關于AS發(fā)病機制，眾多發(fā)病假說先后被提出，但其確切病因和發(fā)病機制迄今尚未完全闡明〔7〕。AS的形成主要是脂質沉積于內膜下引起的一系列病變。因此高脂血癥作為AS形成過程中一個重要的、獨立的危險因素，越來越受到人們的重視。單核細胞進入內皮下形成泡沫細胞是AS發(fā)生的重要事件。因而研究單核細胞遷入內皮下間隙的機制對于闡明AS的發(fā)生發(fā)展具有十分重要的意義。而在吸引白細胞遷移的過程中主要是趨化因子在起作用。

RANTES屬于CC型趨化因子，由正常T細胞表達和分泌，是一種可溶的分子量為8 kD的小分子蛋白質〔8〕，具有多種不同的生物學功能，對多種白細胞有趨化和激活作用。Veillard等〔9〕報道在復制C57BL/6J(LDLR-/-)小鼠高膽固醇血癥模型基礎上通過免疫組化染色檢測到病灶局部巨噬細胞源性泡沫細胞、T淋巴細胞高表達RANTES。這些都表明RANTES在AS形成中可能起著非常重要的作用。而對于高脂血癥大鼠病灶局部是否表達RANTES增多尚未見報道。本實驗提示高脂血癥可以引起大鼠動脈病灶局部表達趨化因子RANTES增多。趨化因子的作用都是與其相應受體的表達密切相關的。Schecter等〔10〕發(fā)現AS病變處的平滑肌細胞表達CC型趨化因子受體。國內也有研究表明同型半胱氨酸(Hcy)可誘導培養(yǎng)的單核細胞和大鼠動脈平滑肌細胞CCR1的表達〔11，12〕。本實驗說明高脂血癥不僅可以引起大鼠動脈壁細胞表達趨化因子RANTES增多，也可以增強其受體CCR1的表達。所以，大鼠動脈壁細胞表達RANTES及CCR1增強，可能是高脂血癥引起AS形成的機制之一。IL-2是一種具有廣泛生物活性的細胞因子，其主要生物學功能是活化T細胞，促進細胞因子產生;刺激NK細胞增殖，增強NK殺傷活性;促進B細胞增殖和分泌抗體;激活巨噬細胞〔13～15〕。有研究報道IL-2在小鼠陰道白假絲酵母菌病感染模型中增加RANTES的表達，且有報道IL-2可以增強培養(yǎng)的T細胞上 CCR-1的表達，且呈劑量依賴性〔16，17〕。但在高脂血癥形成AS過程中IL-2是否也起著重要作用還不清楚。本文通過檢測高脂血癥SD大鼠主動脈壁細胞IL-2表達情況來觀察IL-2在AS形成中的作用。實驗結果顯示IL-2在動脈壁細胞表達增強，其可能通過進一步誘導RANTES和CCR1表達增多而促使AS形成的，從實驗結果看IL-2可能也是高脂血癥引起AS形成的原因之一。

辛伐他汀是治療AS的傳統(tǒng)藥物，可以抑制內源性膽固醇的合成〔18〕，具有降低血脂的作用，最近又發(fā)現辛伐他汀除了調脂作用外還有抗炎、抗氧化、抑制平滑肌增殖的作用〔19～22〕?，F已普遍證實辛伐他汀對高脂血脂引起的AS治療效果是比較好的。本研究表明高脂血癥可能通過誘導大鼠胸主動脈血管壁細胞中IL-2、RANTES和CCR-1的表達引起AS的發(fā)生，辛伐他汀可以很好地抑制這一過程，為臨床患者通過降低IL-2、RANTES和CCR-1的表達來預防AS的發(fā)生提供了理論基礎。

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