伏寒顆粒對(duì)先天伏寒小鼠模型免疫相關(guān)因子的影響

郭家娟 張 爽 李亦男 黃永生

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021)

“先天伏寒”理論是黃永生教授基于多年臨床實(shí)踐，結(jié)合前人伏邪理論，創(chuàng)新性提出的中醫(yī)病因?qū)W說。經(jīng)過多年臨床實(shí)踐，已經(jīng)基本完備了先天伏寒證候的診療規(guī)范，組方伏寒顆粒應(yīng)用于臨床，取得了滿意的療效。為深入研究先天伏寒證候，并且使先天伏寒證候及伏寒顆粒的研究更客觀化，本實(shí)驗(yàn)以建立先天伏寒動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，觀察伏寒顆粒對(duì)先天伏寒動(dòng)物模型免疫相關(guān)因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，體重(23±2)g，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):SCXK-(J)2011-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 氫化潑尼松注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司，生產(chǎn)批號(hào):13031011);伏寒顆粒(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，批準(zhǔn)文號(hào):Z2013A004);金匱腎氣丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，生產(chǎn)批號(hào):13030925)。

1.3 試劑盒 大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-4 酶聯(lián)免疫分析ELISA試劑盒，均由上海邦奕商貿(mào)有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 FAIO04電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司);京立LDZ5-2離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);TH-212智能數(shù)字測溫儀(北京鴻鷗成運(yùn)科技有限公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 腎陽虛模型的建立 4周齡Wistar大鼠48只，隨機(jī)數(shù)字表法選取38只，雌雄各半為腎陽虛模型組;10只為正常對(duì)照組。腎陽虛模型組予氫化潑尼松腹腔注射，每只3.6 mg/100 g，連續(xù)14 d。同時(shí)附加寒冷因素:將大鼠分別置于2℃ ～4℃的冷水中游泳，每次5 min，1次/d，共14 d。造模完成后，觀察精神狀態(tài)、體重、皮毛光澤度、豎毛現(xiàn)象、反應(yīng)靈敏度、是否喜歡擁擠在一起、大便濕度等一般狀態(tài)確定造模是否成功。正常對(duì)照組常規(guī)喂養(yǎng)。

1.5.2 先天伏寒模型的建立 選取具有典型腎陽虛表現(xiàn)的腎陽虛模型組大鼠20只，另取正常的6周齡Wister大鼠10只，用摸球法隨機(jī)平均分配為正常雄加陽虛雌、陽虛雄加陽虛雌、陽虛雄加正常雌各5對(duì)，分別同籠產(chǎn)子，得到的子代分別為正常雄加陽虛雌組、陽虛雄加陽虛雌組、陽虛雄加正常雌組，共同組成先天伏寒模型組。

1.5.3 灌胃給藥 先天伏寒模型大鼠常規(guī)喂養(yǎng)至4周齡，通過一般狀態(tài)觀察，選取具有先天伏寒狀態(tài)表現(xiàn)的大鼠，用查隨機(jī)數(shù)字表法取45只，體重(23±3)g。用摸球法平均分成先天伏寒模型伏寒顆粒組，先天伏寒模型腎氣丸組，先天伏寒模型空白對(duì)照組。伏寒顆粒組每日給予伏寒顆粒溶液(濃度10.4%)2.5 ml/100 g灌胃。腎氣丸組每日予以金匱腎氣丸溶液(濃度5.2%)2.5 ml/100 g灌胃，空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃，共14 d。

1.5.4 觀察指標(biāo) 各組分別進(jìn)行一般狀態(tài)觀察，口腔及前后爪溫度測定，血清 IFN-γ、IL-4、hs-CRP、IL-6、TNF-α 含量測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件計(jì)量資料均以x±s表示，多組間兩兩均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組一般狀態(tài)表現(xiàn) 先天伏寒模型鼠喂養(yǎng)至4周齡，與同周齡腎陽虛模型鼠比較，體重稍有減輕，皮毛光澤度更差，豎毛現(xiàn)象更加明顯，反應(yīng)靈敏度更差，更喜歡擁擠在一起相互取暖，飲水量增加，大便濕度更高。

經(jīng)14 d灌胃治療，先天伏寒模型伏寒顆粒組與先天伏寒模型腎氣丸組在一般狀態(tài)表現(xiàn)方面較治療前均有所改善，精神狀態(tài)恢復(fù)，體重增加，皮毛光澤度改善，反應(yīng)靈敏度增加，豎毛現(xiàn)象改善，飲水量減少，常喜歡擁擠在一起的現(xiàn)象減少，大便較前干燥。先天伏寒模型伏寒顆粒組較先天伏寒模型腎氣丸組改善更明顯。先天伏寒模型空白對(duì)照組未見明顯變化。

2.2 口腔及前后爪溫度測定 先天伏寒模型組口腔及前后爪溫度與正常對(duì)照組對(duì)比有顯著性差異(P＜0.01)。腎陽虛模型組與正常對(duì)照組小鼠比較，后爪(P＜0.01)及口腔和前爪溫度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。先天伏寒模型組與腎陽虛模型組比較，口腔、前爪溫度(P＜0.01)及后爪溫度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3組先天伏寒模型組口腔、前、后爪溫度對(duì)比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

經(jīng)過2 w灌胃，與空白組對(duì)照對(duì)比，伏寒顆粒組和腎氣丸組口腔及前后爪溫度均有回升(P＜0.01，P＜0.05)。伏寒顆粒組口腔及前后爪溫度回升較腎氣丸組明顯(P＜0.05)。見表2。

2.3 免疫指標(biāo)檢測 與同周齡腎陽虛模型組比較，先天伏寒模型組血清 hs-CRP、IL-6、IL-4、TNF-α 含量增高，IFN-γ 含量、Th1/Th2比值顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);正常雄加陽虛雌組，陽虛雄加正常雌組，陽虛雄加陽虛雌組之間相互比較差異不明顯(P＞0.05)。見表3。

與空白對(duì)照組比較，伏寒顆粒組血清hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4含量顯著降低，IFN-γ的含量及Th1/Th2比值顯著升高(P＜0.01);腎氣丸組血清 hs-CRP、IL-4含量顯著降低(P＜0.01)，IFN-γ的含量及Th1/Th2比值顯著升高(P＜0.01)，血清TNF-α、IL-6含量降低(P＜0.05)。與腎氣丸組相比，伏寒顆粒組血清 hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ 含量，Th1/Th2 比值有差異(P＜0.05)。伏寒顆粒與腎氣丸對(duì)先天伏寒模型免疫相關(guān)因子均有影響，伏寒顆粒對(duì)先天伏寒模型免疫相關(guān)因子紊亂狀態(tài)的改善優(yōu)于腎氣丸。見表4。

表1 先天伏寒小鼠與腎陽虛小鼠及正常小鼠口腔、前后爪溫度比較(x±s，n=6，℃)

表2 伏寒顆粒與腎氣丸對(duì)先天伏寒小鼠口腔及前后爪溫度的影響(x±s，n=6，℃)

表3 先天伏寒小鼠與腎陽虛小鼠免疫因子比較(x±s，n=6)

表4 伏寒顆粒與腎氣丸對(duì)先天伏寒小鼠免疫因子的影響(x±s，n=6)

3 討論

先天伏寒動(dòng)物模型是以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，通過模擬先天伏寒“男女媾精，陽氣不足，寒伏于內(nèi)”的病因理論來進(jìn)行造模。先天伏寒于腎是其病因所在，隨著病程的發(fā)展，可形成在下的陰寒格陽于上，陽不入陰，其癥狀表現(xiàn)除手足涼、以足涼為主的脾腎陽虛證等真寒之象外，還表現(xiàn)有口干、心煩等假熱之象。本研究用腎陽虛大鼠同籠產(chǎn)子，通過觀察新生鼠一般狀態(tài)表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)先天伏寒模型大鼠顯現(xiàn)出明顯的“先天伏寒”癥狀，即體重減輕皮毛光澤度差，豎毛現(xiàn)象明顯，反應(yīng)靈敏度下降，喜歡擁擠在一起相互取暖，大便濕度高等寒象(真寒)，并且較腎陽虛模型鼠嚴(yán)重;同時(shí)表現(xiàn)有飲水量增加的熱象(假熱)。先天伏寒模型的這種寒熱錯(cuò)雜表征與先天伏寒證候特點(diǎn)一致。

先天伏寒課題組前期的研究表明，先天伏寒證亞健康人群血清 IL-6、TNF-α水平升高，先天伏寒證候與陽虛證候存在著相似的炎癥因子升高，但先天伏寒證的血清hs-CRP升高更明顯〔1〕。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，此先天伏寒模型造模方法得到的動(dòng)物模型較符合先天伏寒證候本質(zhì)，為進(jìn)一步探討理想的先天伏寒動(dòng)物模型提供了理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。先天伏寒證候存在免疫系統(tǒng)紊亂，除先天伏寒課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明的hs-CRP、TNF-α、IL-6 增高外，可能存在 Th 亞群紊亂，以 IFN-γ、Th1/Th2比值降低、IL-4增高為特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)微觀生物學(xué)指標(biāo)可作為先天伏寒證候進(jìn)一步研究的參考。

中醫(yī)治療的根本原則是“治病求本”，求本是任何疾病實(shí)施治療時(shí)都應(yīng)首先遵循的原則。黃永生教授在遵循先賢治病求本理論基礎(chǔ)上，通過對(duì)多年臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，認(rèn)為先天伏寒證究其根本病性屬陰，病因?yàn)橄忍旆谀I，病機(jī)特點(diǎn)為“氣(陽)虛氣滯、寒熱錯(cuò)雜”，寒為陰邪，隨著人體腎氣的衰退，脾腎之陽受損，治療上首要任務(wù)為溫補(bǔ)脾腎之陽，同時(shí)補(bǔ)益中氣。用仙茅，仙靈脾、巴戟天以溫補(bǔ)脾腎之陽，用黃芪、白術(shù)補(bǔ)益中氣、充健脾氣。伏寒于腎，寒盛于下，使陽無宅，逼陽外走，浮躍于上，故在益氣溫陽的同時(shí)，還加用苦寒而降的知母、黃柏，引陽歸陰，使真龍歸于腎水，生化無窮。用辛溫發(fā)散、醒脾開胃的清夏，暢達(dá)氣機(jī)升降之路，使肺氣宣降，陰火下行暢達(dá)無阻。現(xiàn)今社會(huì)紛繁復(fù)雜，人們多處在所愿不遂的心理狀態(tài)之中，故疏肝理氣法要貫徹治療的始終，應(yīng)用理氣之品枳殼，合行滯止痛之品青皮以疏肝理氣;最后輔以辛甘之品當(dāng)歸，補(bǔ)血活血的同時(shí)助黃芪以益氣健脾;理氣溫中之品砂仁以疏泄氣機(jī)，醒脾開胃。根據(jù)以上，黃永生教授立方伏寒顆粒，針對(duì)先天伏寒證進(jìn)行治療，臨床收效明顯〔2〕。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，伏寒顆粒對(duì)先天伏寒證的療效優(yōu)于腎氣丸，可有效改善先天伏寒模型免疫因子的紊亂狀態(tài)，使血清免疫因子(hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ、Th1/Th2 比值)水平呈正向改變趨勢。以方測證，說明本實(shí)驗(yàn)得到的先天伏寒大鼠模型比較符合先天伏寒證候特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究先天伏寒動(dòng)物模型提供了理論及實(shí)踐參考。

1 崔英子.從“先天伏寒”論治冠心病及其與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫相關(guān)因子關(guān)系的研究〔D〕．長春:長春中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010:95-111.

2 崔英子，郭家娟，黃永生.從先天伏寒論治冠心病心絞痛126例臨床觀察〔J〕．中醫(yī)雜志，2010;51(6):516-9.