姜黃素對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥雌激素生成的影響

張沁舒 方 毅 陳 蓉 王 力 姜 蓉

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMS)是一種由內(nèi)分泌、免疫、基因異常等因素共同引起的雌激素依賴性與自身免疫性炎癥疾病。環(huán)氧化酶(COX)-2前列腺素E2(PGE2)-芳香化酶(P450)-雌二醇(E2)通過正反饋形式相互促進雌激素生成〔1〕，相關(guān)炎癥因子白介素-1β(IL-1β)可促進COX-2合成并維持易于異位內(nèi)膜生長的局部內(nèi)環(huán)境〔2〕。中藥單體姜黃素已被證實可抑制異位子宮內(nèi)膜血管生成〔3〕和體外異位內(nèi)膜細胞分泌 E2〔4〕，并可誘導(dǎo)異位細胞凋亡〔5〕。但其對EMS雌激素正反饋生成代謝酶的研究國內(nèi)外還未見報道，故本實驗觀察姜黃素對雌激素生成代謝酶及IL-1β的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠65只，體重180～220 g，性成熟未交配，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(渝)2007-0001。

1.2 實驗藥物 姜黃素(化學(xué)式C21H20O6，分子量368.38，純度大于 95%，批號:201011)與羧甲基纖維素鈉(編號:S14L27-250g)購自生工生物(上海)有限公司，苯甲酸雌二醇注射液購自杭州動物藥品廠(批號:100716)，孕三烯酮膠囊購自北京紫竹藥業(yè)有限公司(批號:53100201)。

1.3 實驗試劑 E2發(fā)光免疫分析(ECLIA)試劑盒購自Roche公司(批號:110318)，PGE2 ELISA試劑盒購自 R＆D公司(批號:E10089)。IL-1βELISA試劑盒(批號:101213)、濃縮型DAB顯色試劑盒(編號:ZLI-9018)購于北京中杉金橋公司。免疫組化染色試劑盒(編號:SP-0022)、兔抗大鼠P450arom(編號:bs-0732R)和COX-2多克隆抗體(編號:bs-0114R)均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物建模 隨機選取55只處于動情期的大鼠，用自體子宮內(nèi)膜移植手術(shù)法建立EMS動物模型〔6〕:以10%水合氯醛(200 mg/kg)腹腔麻醉，開腹剪下大鼠左側(cè)約8 mm的子宮段，剪成4 mm×4 mm的組織2塊，縫于右側(cè)腹壁和子宮壁。對剩余10只行假手術(shù)，把剪下的子宮段丟棄。術(shù)后連續(xù)3 d肌注慶大霉素，4 d肌注苯甲酸雌二醇。常規(guī)飼養(yǎng)3 w后開腹，發(fā)現(xiàn)移植物體積增大，表面有囊狀小泡聚集，病理檢驗提示成模。

1.4.2 分組給藥 55只造模大鼠，術(shù)后死亡3只，造模失敗7只，造模成功45只。將造模成功的大鼠隨機分組:姜黃素高劑量組(n=9)，姜黃素中劑量組(n=8)，姜黃素低劑量組(n=9)，孕三烯酮組(n=9)，模型組(n=10)。剩下非造模大鼠為假手術(shù)組(n=10)。根據(jù)等效劑量的直接折算法〔7〕，姜黃素組的劑量分別選用2倍大鼠等效劑量(100 mg/kg)、1倍(50 mg/kg)與0.5倍(25 mg/kg)作為其高、中、低劑量，孕三烯酮組給予孕三烯酮(0.5 mg/kg)，上述四組都用生理鹽水與0.5%的羥甲基纖維素鈉配成4 ml混懸液，模型組與假手術(shù)組則給予4 ml生理鹽水。連續(xù)3 w對大鼠每天一次灌胃給藥后，麻醉開腹取腹主動脈血液，3 ml生理鹽水沖洗腹腔后吸取腹腔液，均離心取上清;剪下異位移植物(假手術(shù)組取正常子宮內(nèi)膜組織)，測量體積后，一部分用10%甲醛溶液固定，另一部分勻漿取上清待測保存。

1.4.3 觀測指標 ①用兩腳規(guī)測量各組異位內(nèi)膜移植物體積V(長×寬×高)mm3。②將取下的異位及正常子宮內(nèi)膜組織在24 h內(nèi)行脫水、透明、浸蠟、包埋及5μm厚度連續(xù)切片，之后HE染色。③用ECLIA檢測子宮內(nèi)膜組織E2，ELISA檢測組織PGE2、血清和腹腔液 IL-1β。④用SP法測量各組子宮內(nèi)膜P450arom、COX-2蛋白，在高倍鏡(400×)下，每張切片隨機選取5個不重復(fù)視野，陽性標準為棕黃色區(qū)域，用Image-Pro Plus6.0軟件進行分析，計算每個視野平均光密度，取其5個視野的平均值以表示該切片P450和COX-2的表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗、Games-Howell檢驗及配對T檢驗。

2 結(jié)果

2.1 異位子宮內(nèi)膜體積測量 治療后模型組移植物體積與治療前各組相比無明顯差異(P＞0.05)。與治療前各組及模型組比較:姜黃素高、中、低劑量組及孕三烯酮組治療后異位組織體積明顯縮小(P＜0.05)，見圖1。治療后，與孕三烯酮組比較，姜黃素高、中劑量組體積無明顯差異(P＞0.05)，低劑量組體積偏大(P＜0.05)，見表1。假手術(shù)組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織體積為0。

2.2 子宮內(nèi)膜組織HE染色 假手術(shù)組的正常子宮內(nèi)膜上皮細胞多為柱狀，胞核排列整齊，清晰可見，間質(zhì)細胞分布均勻，腺腔完整;而模型組異位子宮內(nèi)膜上皮細胞多見空泡，胞核排列散亂，間質(zhì)疏松，可見血管增生，見圖2。

2.3 ECLIA和ELISA法檢測組織E2、PEG2、血清與腹腔液IL-1β 與模型組比較，姜黃素高、中、低劑量組及孕三烯酮組大鼠E2、PGE2、血清與腹腔液IL-1β均下降(P＜0.05)。與孕三烯酮組比較，姜黃素高劑量組E2無明顯差異(P＞0.05)，中、低劑量組含量偏高(P＜0.05);高、中劑量組PEG2無明顯差異(P＞0.05)，低劑量組含量偏高(P＜0.05)，見表2。

表1 大鼠異位子宮內(nèi)膜組織體積(x±s，mm3)

圖1 模型組與治療組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織

圖2 假手術(shù)組與模型組大鼠子宮內(nèi)膜(HE，×400)

表2 各組大鼠E2、PGE2與IL-1β的含量及大鼠子宮內(nèi)膜P450arom、COX-2蛋白表達的比較(x±s)

2.4 SP法檢測P450arom、COX-2蛋白 非假手術(shù)組異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞質(zhì)中P450arom與COX-2呈不同程度的棕黃色表達，假手術(shù)組幾乎無P450arom與COX-2表達。與模型組比較，姜黃素高、中、低劑量組與孕三烯酮組P450arom與COX-2表達均顯著降低(P＜0.05)。與孕三烯酮組比較，姜黃素中劑量組P450arom無明顯變化(P＞0.05)，高劑量組含量偏低(P＜0.05)，低劑量組含量偏高(P＜0.05);而姜黃素高、中、低劑量組COX-2表達量均偏高(P＜0.05)，見圖3、圖4和表2。

圖3 P450arom在大鼠子宮內(nèi)膜的表達(SP，×400)

圖4 COX-2在大鼠子宮內(nèi)膜的表達(SP，×400)

3 討論

COX-2、PGE2、P450是局部雌激素生成代謝的重要酶及因子:COX-2可促進PGE2合成，PGE2可促進P450arom合成，而P450arom則可促進雌激素的合成，并在17β-羥類固醇脫氫酶Ⅰ的協(xié)助下使之轉(zhuǎn)變?yōu)楦呱飳W(xué)活性的雌二醇，雌二醇又可增強COX-2的活性，如此反復(fù)，形成正反饋環(huán)〔1，2〕，使體內(nèi)雌激素水平及活性增高。而IL-1β則可刺激COX-2的表達，在雌激素生成過程中起到“煽風點火”的作用。除了直接影響雌激素生成代謝，雌激素正反饋環(huán)的酶及相關(guān)炎癥因子IL-1β還可通過多環(huán)節(jié)、多渠道交叉促進EMS的發(fā)生和發(fā)展:COX-2可抑制機體免疫清除;上調(diào)金屬素蛋白酶(MMPs)表達，增強異位內(nèi)膜細胞黏附、遷移及侵襲的能力〔8〕;還可促進異位內(nèi)膜細胞增殖與血管生成〔9〕。PGE2通過上調(diào)類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)的活性，也可增加雌激素合成;還能上調(diào)成纖維細胞生長因子-9(FGF-9)含量，促進異位細胞增殖，抑制凋亡與免疫清除〔10〕;并能促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)釋放及白細胞聚集，引起異位內(nèi)膜血管增生和局部病灶免疫炎癥反應(yīng)〔11〕。IL-1β為一種前炎性介質(zhì)，是把雌激素合成與免疫-炎癥反應(yīng)兩種病理過程聯(lián)系在一起的中間環(huán)節(jié)，不僅能通過COX-2間接刺激雌激素合成，還能誘導(dǎo) IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、正常 T 細胞表達和分泌的調(diào)節(jié)活化蛋白(RANTES)等細胞因子，引起免疫-炎癥反應(yīng)，使異位內(nèi)膜細胞更易黏附、侵襲，并刺激血管生成，為異位內(nèi)膜的生長提供一個良好的腹腔內(nèi)環(huán)境〔12〕。

本研究提示與雌激素正反饋環(huán)相關(guān)的酶和因子含量的改變，可促進局部異位內(nèi)膜細胞及外周組織原位合成雌激素，增加腹腔炎癥因子釋放，改變機體免疫功能，維持機體高雌激素水平和腹腔炎癥內(nèi)環(huán)境。經(jīng)姜黃素治療過后，上述酶和因子較模型組明顯降低，異位組織體積縮小。高劑量姜黃素除了降低COX-2效果稍不如孕三烯酮，其他效同，且副作用小，證明姜黃素能通過抑制PGE2、P450arom、COX-2與IL-1β的表達，阻斷雌激素生成正反饋環(huán)，使具有高生物學(xué)活性的E2生成減少，并可能通過各因子的一系列交叉作用機制抑制異位子宮內(nèi)膜生長。

姜黃素具有抗炎、抗腫瘤的作用，可抑制人軟骨細胞和結(jié)腸癌COX-2的表達，使PGE2減少，還可抑制肺泡細胞IL-1β產(chǎn)生〔13〕，但姜黃素對上述因子在 EMS中的影響還尚未報道。EMS是雌激素依賴炎性疾病，本研究證明其不僅有抗感染效應(yīng)，還有抗雌激素作用。而長期應(yīng)用孕三烯酮會出現(xiàn)陰道不規(guī)則出血、閉經(jīng)、座瘡等副作用，但應(yīng)用姜黃素出現(xiàn)副作用還未見報道。故較之孕三烯酮，姜黃素有望成為長期治療內(nèi)異癥的潛在中藥成分，為以后EMS的臨床新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 Rizner TL.Estrogen metabolism and action in endometriosis〔J〕．Mol Cell Endocrinol，2009;307(1-2):8-18.

2 Kao AP，Wang KH，Long CY，et al．Interleukin-1beta induces cyclooxygenase-2 expression and promotes the invasive ability of human mesenchymal stem cells derived from ovarian endometrioma〔J〕．Fertil Steril，2011;96(3):678-84.

3 張 穎，曹 洪，張昌軍.姜黃素抑制子宮內(nèi)膜異位癥微血管密度的實驗研究〔J〕．時珍國醫(yī)國藥，2008;19(8):1979-81.

4 余 崢，王文娟，張昌軍，等.姜黃素抑制子宮內(nèi)膜異位癥雌激素生成的實驗研究〔J〕．時珍國醫(yī)國藥，2010;21(6):1447-9.

5 王澍弘，徐鴻毅，董毅飛，等.姜黃素對體外培養(yǎng)異位內(nèi)膜細胞生長及凋亡的影響〔J〕．中國中醫(yī)急診，2009;18(5):784-6.

6 楊 萍，納冬荃，熊亞龍，等.大鼠子宮內(nèi)膜異位模型的建立與組織學(xué)觀察〔J〕．中國實驗動物學(xué)報，2006;14(2):139-41.

7 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)〔M〕．第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:203.

8 Banu SK，Lee J，Speights VO Jr，et al．Cyclooxygenase-2 regulates survival，migration，and invasion of human endometriotic cells through multiple mechanisms〔J〕．Endocrinology，2008;149(3):1180-9.

9 Horn LC，Hentschel B，Meinel A，et al．Cyclooxygenase-2 expression，Ki-67 labelingindex，and perifocal neovascularization in endometriotic lesions〔J〕．Ann Diagn Pathol，2009;12(6):373-7.

10 王 婧，趙志明，黃向華，等.PGE2信號通路對子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制的影響〔J〕．生殖與避孕，2011;31(8):544-8.

11 Sacco K，Portelli M，Pollacco J，et al．The role of prostaglandin E2 in endometriosis〔M〕．England:Informa Healthcare，2012:134-8.

12 毛 潔，凡利俊.白細胞介素-1β在子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及腹腔液中的變化〔J〕．中國婦幼保健，2008;23(10):1409-10.

13 鄭玉強，鄧立普.姜黃素理作用研究進展〔J〕．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011;13(2):212-4.