大鼠海馬認(rèn)知障礙對糖脂代謝的影響及其與海馬神經(jīng)元凋亡的關(guān)系

杜 森 夏春波 葉 琳 莫文法 鐘毓娟 莫 剛 王海俠

(桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，廣西 桂林 541004)

阿爾茨海默病(AD)和糖尿病(DM)是一組相互關(guān)聯(lián)的復(fù)雜性疾病，有研究表明，60% ～70%的DM患者存在不同程度的認(rèn)知功能障礙，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶能力降低，其發(fā)生癡呆的危險性顯著增加〔1，2〕，而高達81%的AD患者有不同程度的糖代謝異?！?〕。本研究擬分析血糖血脂水平與大鼠海馬腦區(qū)神經(jīng)元凋亡的關(guān)系，為代謝異常的深入研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 Spraque-Dawley(SD)大鼠30只，雌雄不分，體重200～250 g，均由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK桂2007-000。水合氯醛購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，Aβ1～42購自Sigma公司，微量注射器購自西化儀(北京)科技有限公司，血糖血脂檢測試劑盒購自桂林優(yōu)利特集團有限公司，全自動生化分析儀為德國Erba XL-600，凋亡檢測試劑盒TUNEL(POD)(Roche USA)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 認(rèn)知障礙大鼠模型的建立及實驗分組 參照大鼠腦立體定位圖譜，調(diào)整腦立體定位儀，大鼠經(jīng)10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，頭部備皮后固定于腦立體定位儀上，沿頭頂正中切開長約10～15 mm的縱形切口，分離骨膜，在海馬上方用牙科鉆鉆開顱骨，實驗組大鼠海馬注射(前囟后3.8 mm，左旁開2.2 mm，進針2.9 mm)Aβ1～4215 μg，假手術(shù)組注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)，對照組未施加任何干擾因素。利用水迷宮實驗檢測大鼠認(rèn)知能力，認(rèn)知功能障礙判定標(biāo)準(zhǔn):以大鼠從入水至爬上平臺時間(定位航行)、跨越平臺次數(shù)、在原平臺象限時間百分比三項中的任意兩項與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義判定為認(rèn)知功能障礙。

1.3 大鼠血糖血脂水平檢測 造模后大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)45 d，經(jīng)心臟采血后分離血漿，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測大鼠空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL)。

1.4 TUNEL法檢測大鼠海馬神經(jīng)元凋亡 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，心臟灌注固定，斷頭取腦，石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蛋白酶K 37℃孵育20～30 min，浸入3%過氧化氫溶液10 min，PBS洗3 min×3次，滴加50μl TUNEL反應(yīng)混合液，在避光盒中37℃孵育1 h，PBS洗3 min×3 次，滴加 Converter-POD50 μl，37℃ 孵育 30 min，PBS 洗3 min×3次，DAB顯色，中性樹膠封片。以等量標(biāo)記液(不含末端轉(zhuǎn)移酶)代替TUNEL工作液做陰性對照。結(jié)果判定:以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽性神經(jīng)元，在顯微鏡下隨機選擇高倍視野進行凋亡神經(jīng)元計數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 認(rèn)知障礙大鼠血糖血脂水平 大鼠飼養(yǎng)45 d后，表現(xiàn)為體重減輕，體型偏瘦，皮膚粗糙且黯淡無光，全自動生化分析儀檢測結(jié)果顯示，實驗組大鼠FPG、TG、TC、LDL與假手術(shù)組和對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)，HDL未見明顯變化(P＞0.05)。見表1。

表1 認(rèn)知障礙大鼠血糖血脂水平(x±s，mmol/L，n=10)

2.2 認(rèn)知障礙大鼠海馬神經(jīng)元凋亡 凋亡神經(jīng)元細(xì)胞核被染成棕黃色或黃色，染色深淺不一。實驗組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)為71.37%±3.15%，假手術(shù)組和對照組大鼠僅見有零星凋亡神經(jīng)元，且染色較淺，凋亡指數(shù)分別為18.66%±3.20%、15.36%±4.25%，與實驗組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。見圖1。

圖1 認(rèn)知障礙大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL染色結(jié)果(×400)

3 討論

AD和DM關(guān)系密切，兩者不僅在認(rèn)知功能和能量代謝等方面具有相似的臨床表現(xiàn)，而且具有許多共同的病理生理基礎(chǔ)，如胰島素信號傳導(dǎo)途徑異常、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)增加、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等均可能參與疾病發(fā)生，但其具體發(fā)病機制尚未明確〔4〕。目前，許多學(xué)者〔5〕對DM引起AD進行了大量研究，但AD發(fā)病早期是否出現(xiàn)血糖血脂水平改變知之甚少，黃德弘等〔6〕對AD和血管性癡呆(VD)患者血糖、血脂及尿酸水平進行了研究，結(jié)果 AD和VD患者 FPG、TC、TG、LDL水平均顯著升高，但HDL水平表現(xiàn)為明顯降低，認(rèn)為AD和VD患者均存在糖脂代謝紊亂，降脂降糖治療可改善AD和VD臨床癥狀。本實驗研究結(jié)果顯示高血糖高血脂大鼠海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，推測大鼠血糖血脂水平升高可能與海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)，提示AD可能是導(dǎo)致糖尿病糖脂代謝異常的重要因素之一。在解剖結(jié)構(gòu)上，海馬神經(jīng)纖維聯(lián)系廣泛，它與下丘腦、杏仁核、腦干均有極其復(fù)雜的聯(lián)系，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)是神經(jīng)內(nèi)分泌途徑的主要傳出通路，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以通過HPA軸來調(diào)節(jié)外周器官活動，刺激海馬CA3區(qū)、齒狀回和腹側(cè)下腳可導(dǎo)致血漿皮質(zhì)醇明顯下降，損傷海馬結(jié)構(gòu)如腹側(cè)下腳導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素分泌增加〔7〕。Forray等〔8〕認(rèn)為，海馬與下丘腦室旁核(PVN)之間存在直接的神經(jīng)聯(lián)系，也可通過前腦終紋床核(BNST)和其他下丘腦中繼核團豐富的γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元影響PVN神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞活性，從而實現(xiàn)對HPA軸的調(diào)節(jié)?；贏D與DM的相似性，有學(xué)者認(rèn)為，抑制海馬神經(jīng)元凋亡可能對DM腦病和AD的防治均有重要價值〔9，10〕。

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