DNA甲基化與廣西巴馬地區(qū)長壽的相關(guān)性

李春宏 黎湘娟 陸華湘 農(nóng)清清 覃 健 何 敏 張志勇

(廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 南寧 530021)

廣西巴馬縣是長壽之鄉(xiāng)，本課題組之前曾探討過DNA甲基化水平與巴馬長壽的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)巴馬人群和對照組的總體甲基化水平都呈增齡性下降，年齡與甲基化比值呈負(fù)相關(guān)，巴馬縣人群的DNA總體甲基化水平比對照組人群高，提示巴馬長壽現(xiàn)象可能與該地區(qū)人群較高的DNA總體甲基化水平有關(guān)〔1〕。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，借鑒DNA混合池研究基因甲基化的方法〔2〕，尋找與廣西巴馬長壽相關(guān)的超甲基化位點和基因，進(jìn)一步探討DNA甲基化與巴馬長壽的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 在廣西巴馬縣長壽家族中選取60例90～110歲老人組成長壽組，在非長壽家族中選取48～85歲的健康者60例組成對照組。

1.2 主要儀器 紫外分光光度計(Eppendorf Biophotom)，Hybridization system12雜交儀(Roche-NimbleGen)，MS200掃描儀(Roche-NimbleGen)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA制備及混合池的構(gòu)建 根據(jù)“知情同意”的原則抽取研究對象外周靜脈血2 ml，提取基因組DNA。參考Barcellos等〔3〕的方法，構(gòu)建四個DNA混合池:①30例有長壽家族史的100～110歲老人，男5例，女25例;②30例有長壽家族史的90～99歲老人，男4例，女26例;③30例無長壽家族史的48～75歲健康對照者，男5例，女25例;④30例無長壽家族史的76～85歲健康對照者，男6例，女24例。用紫外分光光度計測量每個DNA樣品濃度各3次，取平均值，再將樣品稀釋到終濃度為100 ng/μl，從同一組的30個DNA樣品中各取5μl混合，分別構(gòu)建4個DNA混合池。前兩個混合池為長壽組，后兩個混合池為對照組，長壽組與對照組性別分布無顯著差異。

1.3.2 Roche-NimbleGen MeDIP

1.3.2.1 基因組DNA片段化 用MseI(NEB，R0525S)將基因組DNA消化過夜，然后用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，28104)純化片段化的DNA，最后用分光光度計定量，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢。

1.3.2.2 免疫沉淀甲基化的DNA 將能與甲基化的DNA片段發(fā)生特異性反應(yīng)的momoclonal mouse anti-5-methylcytidine抗體(Abcam，Ab10805)與消化后的DNA孵育過夜。利用羊抗鼠IgG(Dynal，112-01D)將DNA-抗體復(fù)合物沉淀，清洗回收后用蛋白酶K(NEB，P8102)消化過夜，采用酚抽提、乙醇沉淀法回收DNA。

1.3.2.3 DNA擴(kuò)增標(biāo)記 (1)取上述免疫沉淀后的DNA Me-DIP，采用 WGA2 Kit(Sigma，WGA2-50RXN)擴(kuò)增，利用 QIA-quick PCR Purification Kit純化擴(kuò)增后的產(chǎn)物，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及定量。(2)取上述擴(kuò)增產(chǎn)物，利用熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物進(jìn)行klenow酶(NimbleGen Dual-Color DNA Labeling Kit，05223547001)反應(yīng)標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用異丙醇沉淀濃縮并定量。

1.3.2.4 雜交與清洗、芯片掃描 將標(biāo)記好的樣品MeDIP與Roche-NimbleGen提供的雜交液配成合適體積，然后與芯片雜交，采用 Roche-NimbleGen的 Hybridization system12雜交儀42℃雜交過夜。最后分別用洗液Ⅰ、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ清洗芯片，甩干后在Roche-NimbleGen MS200掃描儀行掃描分析。

1.3.2.5 芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析 通過5-甲基胞嘧啶抗體進(jìn)行免疫沉淀、捕獲富集甲基化的DNA片段。采用NimbleScan進(jìn)行圖像分析，將圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，根據(jù)實驗樣品(IP)和對照樣品(input)之間的探針信號比值，用 Kolmogorov-Smirnov檢驗計算 P值，P＜0．01視為甲基化程度較高的序列。

1.4 差異甲基化基因的功能注釋 在分子注釋系統(tǒng)(MAS，http://bioinfo．cap-Italbio．com/mas)上對差異甲基化基因的功能進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果

2.1 差異甲基化的篩選 利用芯片技術(shù)、根據(jù)P＜0．01的判斷標(biāo)準(zhǔn)，共篩查出6 441個超甲基化位點，甲基化值0．6～1．0，其中長壽組392個，發(fā)生在甲基化島的位點有189個;對照組6 049個，發(fā)生在甲基化島的位點有2 407個，長壽組和對照組發(fā)生在甲基化島的超甲基化位點數(shù)比例分別占各組位點總數(shù)的48．2%(189/392)和 39．8%(2 407/6 049)。超甲基化位點共涉及1 618個基因，長壽組比對照組甲基化程度高的基因有133個，存在CpG島的基因有75個，占56．3%(75/133)，共形成160個CpG島;而對照組比長壽組甲基化程度高的基因有1 485個，存在CpG島的基因有640個，占43．1%(640/1485)，共形成1 268個CpG島。

2.2 長壽組超甲基化基因分析

2.2.1 長壽組超甲基化基因的功能注釋 將133個超甲基化基因數(shù)據(jù)輸入在線芯片MAS進(jìn)行GO(gene ontology)分析，發(fā)現(xiàn)該組133個超甲基化基因主要涉及24種生物學(xué)功能，見表1。

表1 長壽組133個超甲基化基因GO功能注釋列表

2.2.2 長壽組超甲基化基因涉及的通路 將133個超甲基化基因輸入MAS在線分析軟件，利用其中的KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該133個超甲基化基因共涉及42個通路。q值越小，數(shù)據(jù)的可信度越高。表2中列舉了排位前20位的通路、涉及的基因數(shù)目及名稱。

2.3 對照組超甲基化基因分析

2.3.1 對照組超甲基化基因的功能注釋 將1 485個超甲基化基因數(shù)據(jù)輸入芯片MAS，發(fā)現(xiàn)該組1 485個超甲基化基因主要涉及24種生物學(xué)功能，見表3。

2.3.2 對照組超甲基化基因涉及的通路 將1 485個超甲基化基因輸入MAS在線分析軟件，利用其中的KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該1 485個超甲基化基因共涉及156個通路。表4中列舉了排位前30位的通路及其涉及的基因數(shù)目。

表2 長壽組133個超甲基化基因涉及的20個通路

表3 對照組1 485個超甲基化基因GO功能注釋列表

2.4 超甲基化基因與疾病的關(guān)系 超甲基化基因涉及的疾病眾多，見表5。同時，單個基因也可能與多種疾病有關(guān)聯(lián)，見表6、表 7。

表4 對照組1 485個超甲基化基因涉及的30個通路列表

表5 長壽組和對照組中與衰老相關(guān)疾病有關(guān)聯(lián)的超甲基化基因

表6 長壽組中涉及較多疾病或健康狀態(tài)的超甲基化基因

表7 對照組中涉及較多疾病或健康狀態(tài)的超甲基化基因列表

2.5 超甲基化基因與其編碼的miRNA 長壽組中有113個超甲基化基因編碼了476個miRNA;對照組中有1 073個超甲基化基因編碼了478個miRNA，兩組超甲基化基因共同編碼的miRNA 有 476 個，包括 miR-103、miR-107、miR-130a、miR-155、miR-24、miR-221、miR-496等。對照組超甲基化基因比長壽組多編碼的兩個miRNA是miRNA-487a和miRNA-587。

3 討論

3.1 DNA甲基化與衰老的關(guān)系 DNA甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，CG兩個核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被加上一個甲基基團(tuán)、形成5-甲基胞嘧的過程。甲基化模式很不穩(wěn)定，受衰老、疾病、理化等因素的影響而發(fā)生改變。某些基因的異常甲基化與衰老有密切的關(guān)系。已有研究表明早衰癥與LMNA、WRN基因突變有關(guān)，當(dāng)基因突變同時伴有異常DNA甲基化時，將能增強(qiáng)發(fā)生該病的可能性，即基因突變與DNA甲基化在該病的發(fā)生過程中起到協(xié)同的作用〔4〕。

在Davide等〔5〕的研究中發(fā)現(xiàn)，與非長壽家族后代比較，長壽老人的后代發(fā)生增齡性總體甲基化水平下降并不明顯，其下降速度較前者慢，且總體甲基化程度較前者高。年齡相仿的兩個后代組人群間比較，有長壽家族史的后代在屢患慢性疾患、接受藥物治療、處方藥使用頻率等方面較沒有長壽家族史的后代少，表明該群體整體健康狀況更好。在兩群體間還篩選獲得有統(tǒng)計學(xué)差異的超甲基化位點，發(fā)現(xiàn)這些位點所在的基因涉及DNA或RNA合成、代謝、細(xì)胞信號通路等生物學(xué)過程。以上發(fā)現(xiàn)提示，長壽家族的后代可能保留了更好的甲基化模式，能增強(qiáng)基因組和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的穩(wěn)定性，因此能推遲或延緩后代人群某些年齡相關(guān)慢性疾病的發(fā)生，達(dá)到延長壽限的目的。

DNA甲基化與年齡有關(guān)，甲基化島會發(fā)生增齡性甲基化水平升高，而非甲基化島的情況卻恰恰相反，即存在增齡性甲基化水平降低的趨勢。位于啟動子區(qū)的CpG島發(fā)生甲基化時，往往會導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)，DNA甲基化程度越高，基因轉(zhuǎn)錄活性越低，反之，甲基化越低，基因表達(dá)越高〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)巴馬長壽現(xiàn)象與DNA甲基化關(guān)系密切，并發(fā)現(xiàn)與長壽呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的超甲基化位點和基因。巴馬地區(qū)人群的長壽現(xiàn)象是否歸因于系列疾病相關(guān)基因CpG島發(fā)生了超甲基化，導(dǎo)致基因表達(dá)受抑制，從而使人群免受疾病而延長了壽限?這還需要以具體的疾病相關(guān)基因進(jìn)行深入的驗證。

3.2 生物學(xué)功能與衰老的關(guān)系 兩組人群的超甲基化基因均涉及24個生物學(xué)功能，且均以細(xì)胞過程、生理過程、生物調(diào)控為主，提示兩組人群的衰老生物學(xué)基礎(chǔ)是相同的。有研究表明，衰老與炎癥反應(yīng)有關(guān)聯(lián)，在隨訪9年的健康人群中發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，20%以上的個體體內(nèi)的炎癥物質(zhì)C-反應(yīng)蛋白(CRP)和白細(xì)胞介素(IL)-6濃度雙倍增長，令人群屢患年齡相關(guān)的心血管疾病的危險度和發(fā)生死亡結(jié)局的風(fēng)險增加〔7〕。年齡相關(guān)的神經(jīng)元退行性病變與RNA氧化損傷有關(guān)，在只出現(xiàn)了輕度認(rèn)知損傷階段、還沒達(dá)到阿爾茨海默病(AD)臨床前期時，在神經(jīng)元中已能檢測到RNA的氧化產(chǎn)物8-羥基鳥苷。與年齡匹配的對照人群比較，最終會發(fā)展為AD的病例中能檢測到更高水平的8-羥基鳥苷〔8〕。端粒是染色體終端結(jié)構(gòu)，對染色體末端起著保護(hù)作用。端粒的長度隨著細(xì)胞的不斷分裂而縮短，其DNA丟失到一定程度時，細(xì)胞隨之發(fā)生衰老和死亡。本課題組之前的研究也表明，巴馬長壽與端粒的長度有關(guān)〔9〕。

3.3 信號傳導(dǎo)通路與衰老、長壽相關(guān)性 生物性衰老過程會同時伴隨著單細(xì)胞水平自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性下降，但在健康老人及百歲老人中，細(xì)胞毒活性卻得到很好的保存，并可持續(xù)其一生，這可能是有助其達(dá)到高齡及百歲的原因〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，在長壽組中有4個高甲基化基因NFATC1、RAET1G、SHC2、ULBP1落在自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號通路上，而對照組則有BID、ITGB2、NFATC1等11個高甲基化基因落在此通路，說明自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性機(jī)制能影響巴馬長壽現(xiàn)象，推測是由于相關(guān)基因發(fā)生超甲基化后，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性降低，從而其相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，抑制自然殺傷細(xì)胞的活性，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫能力。長壽組人群只有較少相關(guān)基因發(fā)生甲基化，故保存有較強(qiáng)的免疫功能，從而壽命得以延長。

同樣，絲裂原活化蛋白激酶信號通路也參與衰老調(diào)控。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)C-美麗線蟲的免疫衰老現(xiàn)象與絲裂原活化蛋白激酶信號通路PMK-1 p38活性下降有關(guān)〔11〕。分析對照組人群壽限較長壽組短的原因，可能與通路上較多相關(guān)基因發(fā)生甲基化、導(dǎo)致基因表達(dá)活性進(jìn)一步下降有關(guān)。

在線蟲、果蠅和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)減少胰島素樣多肽可以延緩生物的衰老從而使其增加壽命〔12〕。在哺乳動物的研究中也發(fā)現(xiàn)胰島素和胰島素生長因子可以影響生物的衰老過程〔13〕。本次研究亦發(fā)現(xiàn)了長壽與胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。推測對照組的多個胰島素信號通路相關(guān)基因甲基化后，降低了基因轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步地加速組織衰老，而長壽組僅有2個基因出現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，故可延緩衰老、增加壽命。

3.4 差異超甲基化基因與疾病的關(guān)聯(lián) 在本次研究中，不管是長壽組還是對照組均存在與年齡相關(guān)疾病有關(guān)聯(lián)的差異超甲基化基因。有意思的是，在長壽組中與長壽有關(guān)的基因無一發(fā)生甲基化，對照組中卻有 ACSL1、C4A、CBS、CNN1、ETFA、HSPA1L、SERPINE1等基因處于超甲基化狀態(tài)，以上基因與脂質(zhì)代謝、補(bǔ)體系統(tǒng)功能、免疫功能、皮膚膠原合成有關(guān)〔14～16〕。一個基因可與多種疾病有關(guān)聯(lián)，長壽組中CCKBR、COL18A1、EGR3、H19、IL11、TIMP-1、S100A1等超甲基化基因涉及幾十種疾病，以腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病為主，有些基因與疾病的關(guān)系已在人群研究中得到驗證，如TIMP1基因與人類皮膚衰老〔17〕、S100A1基因與腎臟腫瘤的關(guān)系〔18〕。疾病相關(guān)基因發(fā)生甲基化后，其轉(zhuǎn)錄活性下降，使人群不易屢患相應(yīng)疾病。對照組中也存在與數(shù)十種疾病相關(guān)的基因ACSL1、ATP5I GCK、ADCY8等，以自身免疫性疾病、結(jié)締組織病、代謝紊亂性疾病多見。GCK基因的失活與糖尿病的關(guān)系已得到證實，甲基化的ADCY8基因是診斷早期胃癌的生物標(biāo)志物，且此成果已取得了專利。由此可知，對照組人群中的特異性基因發(fā)生超甲基化失活后更容易出現(xiàn)相應(yīng)的疾病，致使該人群的健康水平下降，不易維持健康狀態(tài)或達(dá)到長壽。

3.5 超甲基化基因編碼的miRNA與衰老的關(guān)系 miRNA的表達(dá)水平與衰老的關(guān)系已得到不少實驗研究的驗證，并發(fā)現(xiàn)了許多衰老相關(guān)的 miRNA，如 miR-103、miR-107、miR-130a、miR-155、miR-24、miR-221、miR-496等，其表達(dá)水平會隨著年齡的增長而下降。此外，受miRNA調(diào)控的靶基因有 PI3K、c-Kit、H2AX等，靶基因的表達(dá)水平卻會隨著年齡的增長而升高〔19〕。據(jù)文獻(xiàn)報道，PDZD2基因?qū)σ葝u素的產(chǎn)生以及胰島β細(xì)胞的存活起到調(diào)節(jié)的作用，BMP3基因啟動子甲基化與人胃癌發(fā)生有關(guān)〔20〕，以上靶基因在兩組人群中的表達(dá)情況有待深入研究。

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