藍(lán)莓中總黃酮的提取及抗氧化活性研究

古力齊曼·阿布力孜， 阿吾提·艾買爾， 迪麗努爾·馬里克

（新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院新疆烏魯木齊830054）

藍(lán)莓中總黃酮的提取及抗氧化活性研究

古力齊曼·阿布力孜， 阿吾提·艾買爾， 迪麗努爾·馬里克?

（新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院新疆烏魯木齊830054）

文章優(yōu)選藍(lán)莓中總黃酮的最佳提取工藝，考察藍(lán)莓中總黃酮提取液的抗氧化活性。通過單因素試驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)，確定藍(lán)莓中總黃酮的最佳提取條件，通過清除OH·、DPPH·和O-2·以及還原力實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)藍(lán)莓中總黃酮體外抗氧化能力，并與Vc進(jìn)行了比較。藍(lán)莓中總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度40%、液料比1∶18（V∶m）、微波功率250W、超聲功率50W、提取溫度55℃、提取時(shí)間7min；在此工藝條件下，藍(lán)莓中總黃酮提取率最高，其含量達(dá)6.433%?？寡趸钚詼y(cè)定結(jié)果表明，藍(lán)莓中總黃酮的抗氧化性明顯高于Vc，而且對(duì)OH·、DPPH·和O-2·均有較好的清除能力。該方法簡(jiǎn)單、快速，藍(lán)莓總黃酮是一種有效的自由基清除劑。

藍(lán)莓；總黃酮；超聲-微波輔助提取法；抗氧化活性

黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，是許多中草藥的有效成分［1］。它的存在形式有兩種，一種是游離的苷元，另一種是與糖等結(jié)合的苷［2］。黃酮的功效是多方面的，它是一種很強(qiáng)的抗氧劑［3］，能改善血液循環(huán)［4］、降低膽固醇。能降低心肌耗氧量，增加冠脈、腦血管血流量，明顯緩解心絞痛、抗心律失常等，對(duì)防治心肌梗塞、心律失常等也有重要療效［5］等諸多功效，已列為保健食品的一類功能因子。為此，筆者以藍(lán)莓果實(shí)為原料，采用超聲-微波輔助提取法研究藍(lán)莓果實(shí)中總黃酮的提取工藝，優(yōu)選藍(lán)莓中總黃酮的提取工藝，并對(duì)提取液進(jìn)行抗氧化活性研究［6-10］，為利用藍(lán)莓工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類化合物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果實(shí)（采自新疆伊寧市）、蘆丁準(zhǔn)品中（國(guó)藥品生物制品檢定所）、乙醇（95%）、5%的亞硝酸鈉溶液、10%的硝酸鋁溶液、4%的氫氧化鈉溶液、Vc、DPPH自由基、去離子水、硫酸亞鐵溶液（AR）、雙氧水（AR）、水楊酸（AR）。

1.1.2 儀器設(shè)備

UV-7502PCS紫外可見分光光度計(jì)（上海京工實(shí)業(yè)有限公司）；RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海壘固儀器有限公司）；U-3310紫外可見分光光度計(jì)（日本日立公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

精密稱取干燥至恒重的粉碎過的藍(lán)莓果實(shí)粉末1.0g于50mL圓底提取瓶中，在一定料液比、溶劑濃度、溫度、功率、提取時(shí)間等條件下→浸泡→超聲-微波提取→抽濾→濃縮，充分洗凈殘?jiān)鼮V干燥后備用。

1.2.2 最大吸收峰的確定

精確吸取蘆丁溶液3.2mL，置于10mL的容量瓶中，加入35%的乙醇定容至5.4mL，加入0.3mL5%的亞硝酸鈉（NaNO2）溶液，搖勻，放置6min，加入0.3mL10%的Al2（SO4）3溶液混勻，放置6min，再加入4mL4%的氫氧化鈉溶液，混勻，靜置15min，以空白為對(duì)照，立即在400nm-600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)。最大吸收波長(zhǎng)為508nm。

圖1 最大吸收波長(zhǎng)

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及回歸方程建立

精確稱取蘆丁對(duì)照品40mg置于100mL的容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為35%的乙醇定容，精確移取蘆丁對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、2.8、3.2mL，用35%的乙醇定容至5.4mL，加入0.3mL5%的NaNO2溶液，搖勻，放置6分鐘，加入0.3mL10%的Al2（SO4）3溶液混勻，放置6分鐘，再加入4mL4%的NaOH溶液，混勻，靜置15分鐘，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：A=3.6818C＋0.0017，相關(guān)系數(shù)（r=0.9982）。

1.2.4 樣品總黃酮含量的測(cè)定

以藍(lán)莓殘?jiān)鼮樵希?jīng)有機(jī)溶劑浸提總黃酮，提取液減壓過濾后定容至100mL，每次準(zhǔn)確量取1.0mL。代入回歸方程（1）中計(jì)算，得出提取液中總黃酮含量。

總黃酮提取率（%）=C×100×100（w-w×b）×1000×100

式中w—樣品的重量（單位g）；C—提取液中總黃酮含量（單位mg／mL）；b—樣品的含水量（單位%）。

1.2.5 提取條件的優(yōu)化

為了全面考察超聲—微波提取的最佳工藝參數(shù)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲功率、超聲溫度、料液比和超提取聲時(shí)間等4種因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)方案，因素水平如表1所示。

表1 因素水平表

1.2.6 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 羥自由基清除率的測(cè)定

取7支試管各加入9mol／L的FeSO4mL，9mol／L的水楊酸-乙醇溶液1mL，樣品1mL（濃度分別是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6）再加入8.8mol／L的H2O21mL，放入37℃水浴中反應(yīng)0.5h。以去離子水作為參比，空白組用去離子水代替樣品。以Vc（抗壞血酸）作為對(duì)照物，操作同上，在510nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)做三次，取平均值代入下式計(jì)算清除率。

1.2.6.2 DPPH·清除率的測(cè)定

吸取不同質(zhì)量濃度的樣品（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg／mL）2 mL，移入試管中，加0.04mmol／mL DPPH ·的乙醇溶液2.0 mL，置暗處30分鐘，重復(fù)做3次。在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以空白作參比，按下式計(jì)算清除率。

式中，A0代表2 mL DPPH·溶液加入2 mL無(wú)水乙醇；

Aj代表2 mL提取液加入2 mL無(wú)水乙醇吸光度；

Ai代表2 mL提取液加入2 mL DPPH·溶液的吸光值。

取50 mol／L的Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.2）4.5 mL，加入4.2 mL去離子水，混勻后在25℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25℃水浴中預(yù)熱過的3 mmol／L的鄰苯三酚溶液0.3 mL（以10 mmol／L的HCl代替鄰苯三酚作為空白），混勻后立即倒入比色皿中，于420nm處每隔30 s測(cè)定吸光度1次，共測(cè)5 min，計(jì)算對(duì)照溶液吸光度隨時(shí)間的變化率A0。然后依照上面方法實(shí)驗(yàn)，在加入鄰苯三酚前先加入1.0 mL總黃酮提取液，再加入3.2 mL去離子水，其余按上面方法操作，計(jì)算總黃酮提取液吸光度隨時(shí)間的變化率Ai。將A0和Ai代入下式計(jì)算總黃酮提取液對(duì)·的清除率

式中A0為空白的平均吸光度；Ai為樣品的平均吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

1.0 g已烘干粉碎處理過的藍(lán)莓果實(shí)粉末加10mL。微波功率為300W，料液比10∶1，超聲功率50W，乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%。過濾，提取三次合并濾液在40℃-50℃左右濃縮。在508nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖2所示。

圖2 乙醇濃度因素對(duì)提取率的影響

由圖2可知，總黃酮提取率隨乙醇濃度增大而增大，當(dāng)乙醇濃度40%后，提取率開始下降，從成本和得率來(lái)考慮，乙醇濃度為35%-45%較為合適。

2.1.2 料液比對(duì)提取率的影響

1.0 g已烘干粉碎處理過的藍(lán)莓果實(shí)粉末加10 mL其濃度為分別為65%乙醇，提取溫度55℃。微波功率為60W，超聲功率50W。其料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25過濾，提取三次合并濾液在40℃-50℃左右濃縮。在508nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖3所示。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響

由圖3可知，總黃酮提取率跟料液比成正比，料液比達(dá)到1∶15時(shí)，提取率最大；1∶15后，提取率趨于下降，這是因藍(lán)莓果實(shí)中總黃酮含量有限，所以選擇料液比1∶10-1∶20為宜。

2.1.3 微波功率對(duì)提取率的影響

1.0 g已烘干粉碎處理過的藍(lán)莓果實(shí)粉末加10mL其濃度為65%的乙醇，提取溫度55℃，超聲功率50W，微波功率分別為100W、200W、300W、400W、500W過濾，提取三次合并濾液在40℃-50℃左右濃縮。在508nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖4所示。

圖4 功率因素對(duì)提取率的影響

由圖4可知，總黃酮提取率隨微波功率增大而緩慢升高，在200W時(shí)趨近于最大值，故選擇提取功率為100W-300W間較為合適。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

1.0 g已烘干粉碎處理過的藍(lán)莓果實(shí)粉末加10mL其濃度為65%的乙醇，提取溫度55℃。微波功率為400W，超聲功率50W，提取時(shí)間分別為3min、6min、9min、12min、15min。過濾，提取三次合并濾液在40℃-50℃左右濃縮。在508nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖5所示。

圖5 時(shí)間因素對(duì)提取率的影響

由圖5可知，在3min至6min時(shí)提取率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高。當(dāng)提取時(shí)間大于6min時(shí)，藍(lán)莓中總黃酮的提取率下降。故提取時(shí)間以5min-7min較為合適。

2.2 超聲-微波總黃酮提取正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交因素水平如表2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 方差分析

表3 方差分析表

由表2可知，根據(jù)極差R分析，超聲-微波輔助提取藍(lán)莓中總黃酮的最佳工藝條件為A3B2C1D3即乙醇濃度40%、提取時(shí)間6min、微波功率150W、液料比1∶18。各因素對(duì)藍(lán)莓中總黃酮提取量的影響順序?yàn)椋何⒉üβ剩–）＞料液比（D）＞乙醇濃度（A）＞提取時(shí)間（B）。從表3方差分析可知微波功率和料液比表現(xiàn)出顯著性差異，而乙醇濃度和提取時(shí)間未表現(xiàn)出顯著性差異。

2.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 藍(lán)莓中總黃酮提取液對(duì)OH·的清除作用

利用Fenton反應(yīng)，檢測(cè)藍(lán)莓提取液和Vc對(duì)OH·的清除作用，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 藍(lán)莓中總黃酮與Vc對(duì)OH·的清除作用

由圖6可以看出，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，提取液和Vc對(duì)OH·都有一定的清除能力，其效果與添量呈正相關(guān)性。隨著濃度的增大，對(duì)OH·清除能力也增加，呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系?？傸S酮和Vc對(duì)OH·清除率的IC50值分別為0.24 mg／mL和0.45mg／mL，總黃酮對(duì)羥自由基的清除率比Vc強(qiáng)約1.8倍。

2.4.2 藍(lán)莓中總黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除作用

藍(lán)莓中總黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除作用由圖7可看出，總黃酮和Vc都對(duì)DPPH·有一定的清除能力，而且，其清除能力隨著濃度的增加而增大。總黃酮和Vc對(duì)DPPH·清除率的IC50值分別為0.15mg／mL和0.17mg／mL，藍(lán)莓中總黃酮對(duì)DPPH·的清除率比Vc稍強(qiáng)。

圖7 藍(lán)莓中總黃酮和Vc對(duì)DPPH·的清除

2.4.3 藍(lán)莓中總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

圖8 藍(lán)莓中總黃酮和Vc對(duì)超氧陰離子自由基的清除

3 結(jié)論

正交實(shí)驗(yàn)及方差分析結(jié)果表明，以藍(lán)莓為原料，采用超聲-微波輔助法提取黃酮，研究藍(lán)莓黃酮提取分離工藝。藍(lán)莓中總黃酮最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為40%、液料比為1∶18、超聲功率50W、微波功率為250W、提取溫度55℃、提取時(shí)間7min。在此工藝條件下，藍(lán)莓黃酮提取率達(dá)到最大值，即6.644%。用法具有快速、高效、簡(jiǎn)單、且無(wú)污染等特點(diǎn)。

藍(lán)莓提取液的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)莓總黃酮不僅具有較強(qiáng)的還原能力，而且對(duì)OH·、DPPH·均有較好的清除能力，且在一定范圍質(zhì)量濃度內(nèi)對(duì)三者的清除作用呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。因而可知，藍(lán)莓果實(shí)具有較好的抗氧化活性，可以利用藍(lán)莓的這個(gè)特點(diǎn)制作各種抗氧化保健藥品，對(duì)藍(lán)莓的開發(fā)利用有重要意義，為科研工作者們制作該類藥品提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］顧仁勇，朱愛華，等.超聲波預(yù)處理微波萃取葛根總黃酮的工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2011，32（10）：57-58.

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Extraction of Total Flavonoids from Blueberries and Antioxidant Activity

Gulqiman·ABLIZ， Awut·AMAR， Dilnur·MALIK?
（Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang Normal University，Urumqi，Xinjiang，830054，China）

To optimize the best extraction conditions of total flavonoids from Blueberries and to exam the antiox?idant activity of total flavonoids extracts.Methods：Using the orthogonal test of L9（34）to determine the content of total flavonoids and the best optimum extractions and the antioxidant activity was evaluated by the methods of OH·、DPPH··and reducing power and compared with the antioxidant activity of Vc.Results：the extraction conditions of total flavonoids in Blueberries：40%vol ethanol solution、liquid／material radio 18∶1（V∶m）、ultrason?ic power was 50W、microwave power was 250W、extraction temperature was 55℃、extraction time was 7 minutes；Under such conditions，the yield of total flavonoids was 6.433%.Antioxidant activity results showed that antioxidant activity of the flavonoids from Blueberries was obviously higher than Vc，and OH·，DPPH·，and·all have good ability to remove.Conclusion：this method was simple、quick，Blueberry flavonoids is a kind of effective free radical scavenger.

Blueberry；Total flavonoids；Ultrasonic-microwave assisted extraction；Antioxidant activity

R284

A

1008?9659（2015）03?007?08

2015-06-05

新疆少數(shù)民族科技人才特殊培養(yǎng)計(jì)劃科研項(xiàng)目資助（201423121）。

古力齊曼·阿布力孜（1988-），女，新疆阿克蘇人，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物的研究。

?［通訊作者］迪麗努爾·馬里克（1964-），女，新疆烏魯木齊人，教授，主要從事天然產(chǎn)物方面的研究。