脂多糖聯(lián)合MPTP誘導的小鼠慢性帕金森病模型的評價

史肖錦，屈洪黨

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經內科，安徽蚌埠 233000）

研究報告

脂多糖聯(lián)合MPTP誘導的小鼠慢性帕金森病模型的評價

史肖錦，屈洪黨*

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經內科，安徽蚌埠 233000）

目的建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯(lián)合1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導的慢性小鼠帕金森病模型，探討其行為學和黒質多巴胺能神經元細胞的變化情況。方法將20只C57BL/6小鼠隨機分為模型組和對照組，模型組每日腹腔注射LPS（0.25 mg/kg）一次，連續(xù)3 d，最后一次注射LPS 4 h后，每日腹腔注射MPTP（25 mg/kg）一次，連續(xù)2 d，對照組腹腔注射相同量的生理鹽水。8周后用步態(tài)分析和轉棒實驗評價小鼠的行為學能力，免疫組化法觀察黑質酪氨酸羥化酶（TH）陽性細胞變化情況。結果模型組小鼠行為學變化較對照組差異有顯著性（P＜0.05），模型組小鼠中腦黒質區(qū)顯示出嚴重的神經元細胞損傷。結論LPS聯(lián)合MPTP腹腔注射可成功誘導出慢性小鼠帕金森病模型，提示該模型可用于帕金森病的發(fā)病機制及藥物治療效果等相關研究。

LPS；MPTP；帕金森?。恍∈竽Ｐ?；酪氨酸羥化酶

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的神經系統(tǒng)退行性疾病，其主要的病理改變?yōu)楹谫|多巴胺能神經元的進行性丟失和殘留的神經元胞漿中路易小體形成［1］。最近的研究假設PD的發(fā)病機制可能涉及到多個起因，包括（但不局限于）暴露于環(huán)境的神經毒素（如農藥、重金屬）、遺傳學、生活習慣（如農村生活環(huán)境）和氧化應激，免疫炎癥反應也涉及到PD病因學［2，3］。且炎癥不再被認為僅僅是神經退病變過程的一個附帶現(xiàn)象，相反它是一個活躍的貢獻者［4］。目前對PD病因和病理生理機制的認知，主要來源于PD動物模型，因此模擬出一個能反映PD的發(fā)病機制、病理學和行為學方面動物模型，是一個有待解決的問題。目前MPTP和6-OHDA等均是單一因素下誘導的PD模型，凋亡的多巴胺神經元可在短時間內自發(fā)恢復至正常，且僅僅一個因素并不能必然導致人類慢性多巴胺的耗竭［5］。細菌內毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導一系列的炎癥反應，通過激活迷走神經的傳入纖維及中樞神經系統(tǒng)中促炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等，進而激活中樞炎癥過程［6］。研究表明，LPS預處理后應用MPP+（MPTP，1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine的代謝毒物），結果顯示LPS預處理組動物模型的紋狀體DA持續(xù)性減少，超過單獨應用MPP+組，且持續(xù)的時間也較長，表明LPS和MPTP共同作用可放大神經退行性變的過程［7］。本實驗通過注射LPS誘導系統(tǒng)性炎癥后，繼續(xù)注射低劑量的MPTP誘導出慢性PD模型，觀察其行為學和黒質多巴胺神經元細胞的改變情況，證實其更符合PD的緩慢進行性發(fā)病的過程，可成為研究PD的可靠動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性12周齡的C57BL/6J小鼠，20只，體重25～27 g，購自揚州大學比較醫(yī)學中心【SCXK（蘇）2012-004】，飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學院SPF級實驗動物中心【SYXK（皖）2012-002】，標準飼養(yǎng)盒內飼養(yǎng)，每盒5只。溫度控制在18～22℃，自由飲水和攝食，并保持12 h/12 h晝夜循環(huán)。

1.1.2 試劑

脂多糖，MPTP，兔抗酪氨酸羥化酶抗體，生物素標記的二抗，均購自Sigma（美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型

20只C57BL/6J小鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為空白對照組和模型組，每組10只。模型組小鼠每日腹腔注射LPS（0.25mg/kg）一次，連續(xù)3 d。最后一天注射LPS 4 h后，繼續(xù)腹腔注射MPTP（25 mg/kg）一次，連續(xù)2 d，相當于LPS注射3次，MPTP注射2次。空白對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水。

1.2.2 行為學檢測

（1）步長分析

自制一個長1 m、寬10 cm、高20 cm的單向通道，用同樣長寬的宣紙鋪在通道的底部，訓練小鼠穿過通道以測量步長。將小鼠的兩后腳掌涂抹墨汁，放于通道的入口，到達另一端出口后其腳印便留在紙上，測量小鼠同側身體兩個腳印的距離，計算出平均步長。通道的開始和結束的步幅長度均不列入計算，因為小鼠在開始行走時會加速步幅不規(guī)則，而出口小鼠為了逃離通道步幅會變小。

（2）轉棒實驗

將小鼠置于直徑為3 cm的旋轉桿上，轉速調整為20 r/min，每次同時測定5只小鼠，每個隔室中1只。記錄小鼠從轉棒開始轉動至掉離轉棒所經歷的時間，測定時間為5 min，共測5次取平均值，同一只小鼠檢測間隔為30 min。

（3）游泳實驗

將小鼠單獨放入一40 cm×25 cm×16 cm的有機玻璃箱中測試器游泳分數(shù)，水深為12 cm，水溫為（27±2）℃。評分標準如下：3分，3 min內連續(xù)不斷的游泳；2分，大部分時間游泳偶爾漂??；1分，偶爾游泳；0分，四肢無活動。

1.2.3 免疫組化染色檢測小鼠黒質酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的表達

（1）制作中腦黒質石蠟切片

對小鼠進行水合氯醛麻醉，用生理鹽水灌流，4%多聚甲醛灌注內固定，剝離出完整的腦組織浸入多聚甲醛中固定24 h。進行梯度脫水、透明、石蠟包埋，在中腦黑質區(qū)連續(xù)冠狀石蠟切片，選取5張切片行TH免疫組織化學染色。

（2）免疫組化步驟

烘片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，0.01 mmol/L 3%過氧化氫室溫下反應10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次×5 min，抗原修復，高火2 min，使其快速達到95℃左右，低火維持12～14 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min。5%羊血清37℃封閉，去掉多余羊血清，加入一抗4℃過夜，37℃復溫1 h，PBS沖洗3次，每次5 min。加入生物素標記二抗，37℃室溫下反應1 h，PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色，復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，拍照。

1.3 統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行比較，以P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠步長分析、轉棒實驗和游泳實驗的比較

8周末進行的行為學檢測，與對照組相比，模型組小鼠平均步長明顯減少、在轉棒上的時間明顯縮短、游泳分值明顯下降，P均＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義（見表1）。

表1 各組小鼠步長和轉棒實驗數(shù)據(jù)結果比較（±s，n=10）Tab.1 The stride length and rotarod performance in the mice of each group

表1 各組小鼠步長和轉棒實驗數(shù)據(jù)結果比較（±s，n=10）Tab.1 The stride length and rotarod performance in the mice of each group

組別G r o u p s游泳實驗/ m i n S w i m m i n g對照組C o n t r o l 7 . 3 2 ± 0 . 6 3 6 1 8 3 . 1 0 ± 4 0 . 6 6 8 2 . 8 3 ± 0 . 4 0 8模型組M o d e l 5 . 4 1 ± 0 . 2 9 9 6 5 . 5 0 ± 2 1 . 7 5 2 1 . 5 0 ± 1 . 0 4 9步長/ c m S t r i d e l e n g t h轉棒實驗/ s R o t a r o d t e s t

2.2 黒質酪氨酸羥化酶免疫組化結果

與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠中腦黒質區(qū)顯示出嚴重的神經元損傷，多巴胺神經元細胞明顯減少，且表現(xiàn)出更多的神經元細胞的萎縮和損壞，細胞體積變小，突起變短，纖維少而稀疏（見圖1）。

注：a：對照組；b：模型組。圖1 中腦黑質TH免疫組織化學檢測（×100）Note.a：Control；b：ModelFig.1 Representative photomicrographs of TH-immunoreactive neurons in the substantia nigra ofmouse brain（×100）

3 討論

PD是一種與年齡相關的神經退行性疾病，越來越多的研究顯示炎癥與黑質多巴胺能神經元凋亡的相關性［8］。尸檢報告顯示PD患者中腦黒質多巴胺神經元凋亡與小膠質細胞形態(tài)學改變和促炎因子的退化均有關［9］，但是其具體的機制仍未明確［10］。為了更好的研究PD的發(fā)病機制及相應的治療策略，模擬出一個能反應PD的發(fā)病機制、病理學和行為學方面的慢性PD動物模型，是一個急需解決的問題。目前的6-OHDA和MPTP誘導的PD模型均為單一定點注射直接損毀小鼠中腦黑質多巴胺，不能很好的模擬PD慢性的發(fā)病過程。研究表明［11］，PD神經系統(tǒng)進行性退化可能始發(fā)于黒質以外的其他神經系統(tǒng)，故利用神經毒素聯(lián)合注入黒質以外的部位誘導的小鼠帕金森病模型，引起越來越多的人關注。

LPS是一種內毒素［12，13］，對神經元無毒性作用，但它可誘導強大的先天免疫反應，激活小膠質細胞，釋放一系列的細胞炎癥因子，導致黑質紋狀體通路損害和帕金森病行為學癥狀。MPTP［14］為高親脂性化合物，能有效的通過血腦屏障，主要被小膠質細胞識別，被單胺氧化酶氧化成MPDP+，隨后自氧化成毒素MPP+。MPP+被DA神經元攝取，阻斷線粒體復合酶I的活性，大幅度增加氧化應激的水平，從而導致紋狀體多巴胺水平下降，并逐漸導致中腦黒質致密部多巴胺神經元的死亡。研究表明LPS可能會影響血腦屏障，從而影響大腦中MPTP的濃度，系統(tǒng)性注射LPS可以提高MPTP的毒性［15］。且Gao等［16］認為注射LPS后繼續(xù)注射MPTP會產生一種協(xié)同作用，后Byler等［5］利用LPS聯(lián)合MPTP腹腔注射成功誘導出慢性帕金森病小鼠模型，然而這種模型在國內并未引起廣泛關注。

本研究利用LPS聯(lián)合小劑量的MPTP作用于C57BL/6J小鼠誘導慢性帕金森模型，8周末行為學檢測顯示模型組小鼠步長、轉棒時間和游泳分值較對照組均下降，TH免疫組化結果顯示模型組中腦黒質TH陽性細胞數(shù)量較對照組減少，且神經元細胞體積變小，突起變短，纖維少而稀疏。提示LPS聯(lián)合小劑量的MPTP腹腔注射可成功誘導出PD小鼠模型，且更符合PD的緩慢發(fā)病過程，說明此種模型可用于帕金森病的病因、病理生理機制及藥物治療效果的研究。

研究表明［17］，6-OHDA和MPTP誘導的PD小鼠模型僅導致紋狀體多巴胺短時的減少，可很快恢復至正常水平，且缺乏相應的行為學改變，而LPS聯(lián)合MPTP模小鼠型步長縮短及黒質紋狀體多巴胺減少至少可持續(xù)4個月。本研究結果與這一觀點相符合，LPS聯(lián)合MPTP小鼠模型步長縮短及黒質多巴胺神經元損傷較嚴重，持續(xù)時間較長，且該模型未出現(xiàn)小鼠死亡或者誘導運動功能減退失敗的情況。步長縮短是帕金森病患者身上的主要特征［18，19］，故利用步長測定進行行為學檢測，更能反應帕金森小鼠模型的行為學改變情況。

總之，LPS聯(lián)合MPTP腹腔注射可成功誘導出帕金森病小鼠模型，該模型可用于PD的發(fā)病機制和病理生理變化的研究，也可為研究藥物的治療效果提供合適的動物模型。以后可以對小膠質細胞增生、促炎因子的表達以及突觸核蛋白的聚集的情況做出進一步研究。

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Evaluation of a mouse model of Parkinson’s disease induced by lipopolysaccharide plus MPTP

SHIXiao-jin，QU Hong-dang
（the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China）

ObjectiveThe aim of this study was to establish a mouse model of chronic Parkinson’s disease induced by systemic administration of lipopolysaccharide plus1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP），and to study the changes of behavioral manifestation，numbers of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta.M ethodsTwenty C57BLmice were randomly divided into 2 groups：the saline control group and model group.Themice in themodel group received three intraperitoneal（i.p.）injections of LPS（0.25mg/kg），once daily for three consecutive days.Four hours following the final LPS injection，the mice received one subcutaneous injection of low-dose MPTP（25 mg/kg）.Themice of controlgroup were injected with the same volume of saline.Eightweeks later，themotor ability of the mice was evaluated by footprint test and rotarod test.The tyrosine hydroxylase（TH）-positive cellswere observed by immunohistochemical analysis.ResultsCompared with the control group，the scores of behavioral testwere significantly lower，numbers of TH immunoreactive cells were significantly less in the Parkinson’smodel group（P＜0.05）.ConclusionsBehavioralmanifestation，number of dopaminergic neurons in the substantia nigra are significantly changed in the mouse models of Parkinson’s disease produced by repeated injection of LPSplus MPTP，suggesting that this chronic animalmodel can be used in the experimental study for pathogenesis and therapy of Parkinson’s disease.

Lipopolysaccharide，LPS；MPTP；Parkinson’s disease（PD）；Ratmodel；Tyrosine hydroxylase

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0513-04

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.014

2015-05-20

蚌埠醫(yī)學院研究生創(chuàng)新計劃項目（Byycx1406）；教育廳重點項目（KJ2014A163）。

史肖錦（1988ˉ），女，蚌埠醫(yī)學院碩士研究生，研究方向：神經病學。Email：137481290@qq.com

屈洪黨，男，主任醫(yī)師， 研究方向：神經病學的臨床、科研和教學工作。Email：qhd820@souhu.com