高效液相色譜儀對(duì)甲硝唑注射液滅菌工藝篩選研究

李鳳霞 王鳳儒 李宏偉

①黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科 黑龍江 哈爾濱 150040

②哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司 黑龍江 哈爾濱 150025

注射劑系指藥物與適宜的溶劑或分散介質(zhì)制成的供注入人體內(nèi)的溶液、乳狀液或混懸液及供臨用前配制或稀釋成溶液。甲硝唑注射液是甲硝唑加氯化鈉適量使成等滲的滅菌水溶液，是我國(guó)藥品中重要制劑之一，臨床使用非常廣泛[1-2]。新醫(yī)藥改革的逐漸落實(shí)，藥品新版良好生產(chǎn)規(guī)范(good manufacturing practice，GMP)[3]與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的接軌，根據(jù)歐盟風(fēng)險(xiǎn)決策樹的要求，無(wú)菌注射劑產(chǎn)品應(yīng)該使用終端滅菌法，首選風(fēng)險(xiǎn)安全級(jí)別最高的過(guò)度殺滅法(121 ℃，15 min)，如果藥物不能耐受121 ℃的高溫，則可以選擇殘存概率滅菌法(115 ℃，30 min)，對(duì)于溫度敏感的制劑可選擇無(wú)菌生產(chǎn)工藝[4-5]。

甲硝唑注射液是硝基咪唑的衍生物，是一類廣譜抗生素[6-7]。甲硝唑注射液在人體中通過(guò)還原生成具有代謝物抗厭氧菌作用，抑制細(xì)菌的脫氧核糖核酸的合成，從而干擾細(xì)菌的生長(zhǎng)、繁殖，最終致細(xì)菌死亡[8-9]。甲硝唑制劑在臨床上主要用于預(yù)防和治療厭氧菌引起的感染，如敏感菌引起的呼吸道、消化道、腹腔及盆腔化膿性感染，皮膚軟組織、骨關(guān)節(jié)等部位的感染以及脆弱擬桿菌引起的心內(nèi)膜炎、敗血癥及腦膜炎等[10-12]。本研究以甲硝唑注射液中的活性成份甲硝唑的含量為檢測(cè)指標(biāo)，分析不同滅菌參數(shù)對(duì)甲硝唑含量的影響，從而篩選出適用于甲硝唑注射液的最優(yōu)的滅菌工藝參數(shù)。

1 材料及方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀；甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100191-200305；CAS 443-48-1)；甲硝唑注射液(規(guī)格250 ml:500 mg；國(guó)內(nèi)A藥廠；批號(hào)：130401、130402、130403；130401-1、130402-1、130403-1；130401-2、130402-2、130403-2)；流動(dòng)相：水(雙蒸水)，甲醇(80:20)，其他試劑級(jí)別為色譜純。

1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密量取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，加流動(dòng)相溶解，并精密配制成0.25 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3 樣品的制備方法

分別稱取甲硝唑適量，配置成濃度為0.5%藥液為滅菌前藥液，批號(hào)為130401、130402、130403備用；取1/3滅菌前藥液經(jīng)過(guò)度殺滅，可得藥液，批號(hào)為130401-1、130402-1、130403-1備用；取1/3滅菌前藥液經(jīng)殘存概率滅菌法，可得藥液，批號(hào)為130401-2、130402-2、130403-2備用。

(1)未滅菌藥液的制備。稱取甲硝唑50 g，加水至25 L攪拌20～25 min使完全溶解，經(jīng)0.22 μm超濾膜過(guò)濾，灌裝，可得藥液批號(hào)為130401、130402、130403。

(2)過(guò)度殺滅藥液的制備。選用未滅菌藥液(批號(hào)130401、130402、130403)于121℃水浴滅菌15 min，對(duì)應(yīng)批號(hào)為130401-1、130402-1、130403-1。

(3)殘存概率滅菌法藥液的制備。選用未滅菌藥液(批號(hào)130401、130402、130403)于115 ℃水浴滅菌30 min，對(duì)應(yīng)批號(hào)為130401-2、130402-2、130403-2。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水，甲醇(80∶20)；流速為1.5 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)λ=320 nm；進(jìn)樣體積為10 μL；保留時(shí)間為10 min。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性與線性關(guān)系

(1)理論塔板數(shù)計(jì)算甲硝唑＞2000。

(2)將甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.25 mg/ml)逐漸稀釋成濃度分別為21.90 μg/ml、43.80 μg/ml、87.63 μg/ml、175.25 μg/ml、350.50 μg/ml和701.00 μg/ml的溶液。每個(gè)濃度進(jìn)樣10 μl，在上述色譜條件下分析，以峰面積平均值對(duì)其相對(duì)應(yīng)的濃度建立回歸方程。以相應(yīng)峰面積Y對(duì)其進(jìn)樣濃度X(μg/ml)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為：Y=56.78X+997.02(r=0.9999)。線性關(guān)系為21.90～701.00 μg/ml范圍內(nèi)，良好。

2.2 溶液穩(wěn)定性

精密量取甲硝唑?qū)φ掌啡芤?0.25 mg/ml)，在0 h和24 h分別進(jìn)樣，在上述色譜條件下分析，計(jì)算其峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.03%，甲硝唑注射液在24 h溶液穩(wěn)定。

2.3 精密度

精密量取甲硝唑?qū)φ掌啡芤?0.25 mg/ml)，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)(精密度)為1.00%，表明甲硝唑注射液精密度良好。

2.4 回收率

精密量取甲硝唑注射液濃度已測(cè)定樣品3份，每份1 ml，分別向其中加入甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)液(0.25 mg/ml)0.5 ml、1 ml和1.5 ml作供試品溶液。搖勻進(jìn)樣，每組3次，測(cè)定加樣后溶液中甲硝唑濃度與加樣前溶液中甲硝唑濃度，測(cè)得甲硝唑注射液中甲硝唑的加樣回收率平均99.76%，RSD值為1.21%。

2.5 檢測(cè)線與定量限

取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品(0.25 mg/ml)適量，逐步稀釋，S/N=10為定量限，S/N=3檢測(cè)線，試驗(yàn)結(jié)果定量限為0.6 μg/ml，檢測(cè)線為0.2 μg/ml。

2.6 甲硝唑含量測(cè)定

取滅菌前藥液、過(guò)度殺滅藥液及殘存概率滅菌藥液制備樣品，按上述色譜條件測(cè)定，各平行重復(fù)測(cè)定2次，求其峰面積的平均值，并通過(guò)回歸方程計(jì)算樣品甲硝唑注射液中甲硝唑含量。測(cè)定滅菌前藥液甲硝唑含量分別為101.2%、102.0%及101.5%，采用過(guò)度殺菌法滅菌之后藥液含量分別為101.0%、101.9%、101.5%，測(cè)定采用殘存概率法滅菌后甲硝唑含量分別為101.3%、102.0%、101.5%(見表1)。

表1 甲硝唑樣品含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

根據(jù)歐洲藥典和“CPMP指南備注”的規(guī)定，無(wú)菌產(chǎn)品應(yīng)在灌裝到最終容器中之后進(jìn)行終端滅菌。本研究對(duì)幾種可供選擇的滅菌條件進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)合品種特性，以實(shí)際的研究結(jié)果證實(shí)滅菌工藝條件選擇的合理性。只要條件允許，應(yīng)首選過(guò)度殺滅滅菌工藝，因該工藝的無(wú)菌保證安全性高，對(duì)工藝全過(guò)程的控制要求相對(duì)較低，只要該藥品是嚴(yán)格按照GMP的要求組織生產(chǎn)，即可確保無(wú)菌保證值達(dá)到≤10-6，而不必?fù)?dān)心裝載的生物負(fù)荷和耐熱性。殘存概率滅菌工藝則是從滅菌前微生物污染控制和滅菌過(guò)程控制兩方面入手，使得滅菌F0值較低的情況下也能確保達(dá)到藥典規(guī)定的無(wú)菌保證水平。但需注意到，某些產(chǎn)品在提高滅菌溫度而縮短滅菌時(shí)間后，產(chǎn)生的雜質(zhì)可能會(huì)有所降低，故要結(jié)合藥物的具體情況，考察和評(píng)價(jià)所選滅菌程序?qū)λ幬镔|(zhì)量的實(shí)際影響[13-15]。

通過(guò)對(duì)甲硝唑注射液滅菌前3批藥液含量、不同滅菌參數(shù)甲硝唑含量進(jìn)行測(cè)定，按照上述經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3批滅菌藥液標(biāo)示量的含量變化不大。實(shí)驗(yàn)證明，甲硝唑注射液采用過(guò)度殺滅法、殘存概率滅菌法滅菌后藥液含量差別不大，表明甲硝唑注射液可以耐受終端過(guò)度滅菌法。按照歐盟風(fēng)險(xiǎn)決策樹要求，為了保證注射劑產(chǎn)品的安全性，生產(chǎn)中應(yīng)優(yōu)先選擇終端過(guò)渡滅菌法，并考慮滅菌耐受性，選擇活性成分含量作為依據(jù)，本研究表明，高效液相測(cè)定法快速、準(zhǔn)確，且操作方便。

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