新型丹參素衍生物的合成與抗心肌缺血活性研究

田 霖1，2a，郭海霞3，張 潔4，焦育強(qiáng)1，2，吳秋業(yè)2b，張 川1，2a（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，2a.中藥鑒定教研室，2b.有機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433；3.解放軍 266醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北 承德 067000；4.國(guó)防大學(xué)第二門診部，北京 100039）

·論著·

新型丹參素衍生物的合成與抗心肌缺血活性研究

田 霖1，2a，郭海霞3，張 潔4，焦育強(qiáng)1，2，吳秋業(yè)2b，張 川1，2a（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，2a.中藥鑒定教研室，2b.有機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433；3.解放軍 266醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北 承德 067000；4.國(guó)防大學(xué)第二門診部，北京 100039）

目的通過對(duì)丹參素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以改善其穩(wěn)定性和藥理活性。方法以中藥提取的丹參素鈉為起始化合物，經(jīng)酯化反應(yīng)、甲氧基保護(hù)酚羥基、硝化反應(yīng)等合成新型的丹參素衍生物。建立心肌細(xì)胞缺氧模型，用M TT方法檢測(cè)丹參素及其衍生物對(duì)缺氧H 9c 2細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果合成了15個(gè)全新的丹參素衍生物，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證；藥理活性實(shí)驗(yàn)顯示，只有少數(shù)目標(biāo)化合物在濃度為5μm o l／L時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)于丹參素的活性。結(jié)論多數(shù)化合物的最大藥理活性未顯現(xiàn)在所選濃度范圍內(nèi)，其活性未必低于丹參素，尚需做進(jìn)一步探討。

丹參素；結(jié)構(gòu)修飾；合成；藥理活性

丹參素為唇形科植物丹參（Salviam iltiorrhiza Bge）中的一種主要化學(xué)活性成分，化學(xué)名為D（＋）－B-（3，4-二羥基苯基）乳酸，結(jié)構(gòu)式見圖1。丹參素具有抑制血小板凝集［1］、抗凝血［2］、降血脂［3，4］、保肝［5，6］、抗炎［7］、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈［8］、抗氧化損傷［9］、抗腫瘤［10，11］等多種藥理活性，對(duì)心血管系統(tǒng)具有明顯的保護(hù)作用，臨床上多用于改善心臟功能［12，13］、抗凝血和改善微循環(huán)［14］等，是研究得比較深入的一種中藥藥效成分。

圖1 丹參素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

提取分離得到的丹參素水溶性強(qiáng)，脂水分配系數(shù)差，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，活性不突出，從而導(dǎo)致成藥性差。因此，前人對(duì)羥基及羧基進(jìn)行了大量結(jié)構(gòu)修飾。王定遠(yuǎn)等［15］對(duì)酚羥基進(jìn)行了成醚和成酯保護(hù)。Dong等［16］分別對(duì)酚羥基進(jìn)行了乙?；蛠喖谆?。張智波等［17］保留苯基乳酸結(jié)構(gòu)，改變了苯環(huán)上的取代基，合成了不同的丹參素衍生物。崔慶彬等［18］在丹參素醇羥基部位進(jìn)行修飾得到新衍生物。鄭曉暉等［19］將羧基成酯，合成了丹參素冰片酯。向卓等［20］在將酚羥基乙酰化的基礎(chǔ)上，將α-羥基也乙?；⑶覍Ⅳ然c傳統(tǒng)抗心肌缺血的硝酸酯類藥物單硝酸異山梨醇酯拼合，得到乙酰丹參素單硝酸異山梨醇酯。為進(jìn)一步研究丹參素的構(gòu)效關(guān)系，在對(duì)丹參素酚羥基進(jìn)行甲基化的基礎(chǔ)上，我們將吸電子基團(tuán)硝基引入丹參素的苯環(huán)，可以降低苯環(huán)的電子云密度，以期增加目標(biāo)化合物的穩(wěn)定性。同時(shí)探索了羧基反應(yīng)成不同酰胺鍵對(duì)丹參素結(jié)構(gòu)和活性的影響，最后，在醇羥基部位成酯，考察醇羥基是否為活性必需基團(tuán)。新型丹參素衍生物結(jié)構(gòu)見圖2。

通過對(duì)丹參素的羥基和羧基進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)改造，以期獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、脂溶性好、生物利用度更高的新型丹參素衍生物。

圖2 新型丹參素衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 儀器 R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Bu c h i公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海豫康科教儀

器設(shè)備有限公司）；85-1型磁力恒溫?cái)嚢杵鳎ㄉ虾Ｖ就娖饔邢薰荆籗HZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；JA100型精密電子天平（上海志威電器有限公司）；AC-P300型核磁共振儀（Bruker Spectmspin公司）；API-300型質(zhì)譜儀（Agilent Technologies公司）；P-1020型旋光儀（Jasco公司）；YRT-3型熔點(diǎn)儀（天大天發(fā)科技有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher公司）。

1.2 試藥 層析硅膠（青島海洋化工有限公司）；無水甲醇、丙酮、濃硫酸、濃硝酸、乙酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、碳酸氫鈉、無水硫酸鈉、氯化鈉（General-reagent公司）；無水碳酸鉀、硫酸二甲酯（Adamas公司）；DMEM、胎牛血清（Hyclone公司）；大鼠H9c2細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所）；DMSO（Am resco公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；丹參素鈉（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室）。

2 方法

2.1 丹參素衍生物的合成 新型丹參素衍生物的合成路線見圖3。

圖 3 新型丹參素衍生物的合成路線

2.2 化合物體外抗心肌缺血活性測(cè)定 通過體外缺氧模型誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞缺氧，提前用丹參素及其衍生物作用于細(xì)胞，觀察丹參素及其衍生物在不同濃度下對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對(duì)照組（陽(yáng)性藥組）、丹參素衍生物組（給藥組）和模型組。

將H9c2細(xì)胞接種于96孔板中，1×105個(gè)／m l，每孔100μl，使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)20～24h后，加藥孵育12h，同時(shí)模型組換低糖無酚紅DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組換完全培養(yǎng)基。給藥組每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔（包括陽(yáng)性藥），模型組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每塊96孔板均設(shè)陽(yáng)性藥組和模型組。缺氧5h，復(fù)氧1h，之后加入M TT繼續(xù)培養(yǎng)4h，最后吸除上清液，每孔加入150m l DMSO置于搖床，至結(jié)晶完全溶解，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定OD值。

3 結(jié)果

3.1 目標(biāo)化合物的波譜數(shù)據(jù) 詳見表1。

表1目標(biāo)化合物的波譜數(shù)據(jù)

3.2 丹參素衍生物的抗心肌缺血活性 丹參素衍生物的藥理活性測(cè)定結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的濃度梯度下，大部分化合物均表現(xiàn)出抗缺氧活性，或隨著濃度升高活性增大（化合物4、7、9、17），或隨著濃度升高活性降低（化合物10、12～16、18），少數(shù)出現(xiàn)不規(guī)律性（化合物5、6），除化合物5、6、12、13、14、15在濃度為5μmol／L時(shí)表現(xiàn)出高于丹參素的活性，其余化合物的活性均低于母藥丹參素，化合物8、11、16則活性較弱或沒有活性。結(jié)果見表2。

4 討論

考慮到酚羥基的不穩(wěn)定性，筆者通過合成空間位阻較小的-OCH3來保護(hù)酚羥基。在構(gòu)思如何修飾羧基的問題上，筆者參考了Wang［21］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在丹參素羧基部位進(jìn)行酰胺鍵修飾能夠保持化合物的抗氧化活性，硝基的引入意在降低苯環(huán)的電子云密度，以期增加目標(biāo)化合物的穩(wěn)定性。起初在進(jìn)行硝化反應(yīng)時(shí)，采用混酸體系（HNO3-H2SO4）［22］對(duì)化合物進(jìn)行硝化，不僅反應(yīng)條件需要冰浴，而且產(chǎn)率較低，僅為28.0%左右。查閱相關(guān)文獻(xiàn)后，改用HNO3-乙酸體系，只需在室溫即可反應(yīng)，后處理簡(jiǎn)單，且產(chǎn)率提高到78.0%。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，硝化反應(yīng)中反應(yīng)物的最佳比例為：1.0g化合物2溶于22m l乙酸，同時(shí)加入1.5m l HNO3。

從藥理實(shí)驗(yàn)整體結(jié)果看，除化合物8、11、16活性低或不具活性外，其余化合物均表現(xiàn)出或多或少的抗心肌缺氧活性，其中化合物5、6、12～15均在濃度為5μmol／L展現(xiàn)出強(qiáng)于丹參素的活性，而且化合物4、7、9、10、12～16、17、18隨著濃度升高活性增大或減小，均未表現(xiàn)出最適藥效濃度時(shí)的藥理活性大小，需要適當(dāng)擴(kuò)大濃度范圍做更為全面的測(cè)定。此外，硝基的選用可能也有不當(dāng)，以何種取代基替換，則仍需繼續(xù)合成大量化合物進(jìn)行更深一步的研究。

Synthesis and anti-myocardial ischem ia activities of novel Danshensu derivatives

TIAN Lin1，2a，GUO Haixia3，ZHANG Jie4，JIAO Yuqiang1，2，WU Qiuye2b，ZHANG Chuan1，2a（1.School of Pharmacy，F(xiàn)ujian U-niversity of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China；2a.Department of Science for Identifying Chinese Materia Medica，2b.Department of Organic Chem istry，School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China；3.No.266Hospital of PLA，Chengde 067000，China；4.Second Out-patient Department，National Defence University，Beijing 100039，China）

ObjectiveTo design and synthesize novelDanshensu derivatives in order to improve their stability and cardioprotective effectagainstmyocardial ischemia.MethodsNovel Danshensu derivativeswere synthesized chiefly via esterification，methoxy phenol hydroxyl protection，nitration and am ine solution reaction.A ll the target compounds were evaluated their biologicaleffects on anti-myocardial ischemiaw ith H 9c2cells in vitro.Results15compoundswere synthesized and further confirmed by1H NMR and MS.Pharmacological studies showed that few synthetic derivatives at 5μmol／L performed a higher biological effect than Danshensu.ConclusionMost derivatives didn＇t show the best activity at the chosen concentration gradient that a further pharmacological trial need to be done.

Danshensu；structuremodification；synthesis；pharmacological activity

表2 丹參素衍生物對(duì)H 9c 2細(xì)胞活性的影響

R285

A

1006-0111（2015）06-0525-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.012

田 霖，碩士研究生.E-mail：sdzbtlin＠163.com.

張 川，博士，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：中藥創(chuàng)新藥物的研究.E-mail：zhangchuan＠smmu.edu.cn.