高壓氧預(yù)處理對(duì)大鼠腸缺血再灌注機(jī)械屏障損傷的影響

代皓，鄭磊，朱洪智，楊艷梅，陳凱

(1武警四川總隊(duì)醫(yī)院成都分院，成都610000;2滄州醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校;3武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

腸道是應(yīng)激的中心器官。在創(chuàng)傷、休克、嚴(yán)重感染時(shí)，全身血液重新分布，引起腸道嚴(yán)重缺血、缺氧性損害，隨后的再灌注進(jìn)一步加重腸道機(jī)械屏障功能破壞，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多臟器功能障礙綜合征(MODS)［1］。高壓氧預(yù)處理可以減輕多臟器的缺血再灌注損傷。2013年9月～2014年6月，我們利用經(jīng)典的夾閉腸系膜上動(dòng)脈的方法［2］復(fù)制大鼠腸道缺血再灌注損傷模型，觀察高壓氧預(yù)處理對(duì)正常及急性腸缺血再灌注機(jī)械屏障損傷大鼠的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g(北京維通利華公司)，雌雄不拘。PBS(Sigma，美國(guó))，葡聚糖藍(lán)-2000(Sigma，美國(guó))，髓過(guò)氧化物酶活力檢測(cè)試劑盒(BioVision，美國(guó))，TNF-α ELISA試劑盒(Sigma，美國(guó))，甲醛(北京鼎國(guó)公司)，50%戊二醛(北京鼎國(guó)公司)。透明動(dòng)物加壓艙(上海楊園醫(yī)用氧艙廠)，透射電子顯微鏡(Hitachi公司，日本)，ELx800光吸收酶標(biāo)儀(BIOTEK，美國(guó))，體視顯微鏡(Olympus，日本)，低溫離心機(jī)(Sigma，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(不阻斷腸系膜上動(dòng)脈，其他處理同缺血再灌注組)、缺血再灌注組(阻斷腸系膜上動(dòng)脈并再灌注)和高壓氧預(yù)處理組(阻斷高壓氧預(yù)處理后阻斷腸系膜上動(dòng)脈并再灌注)各10只。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，22～25℃室溫，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.2 高壓氧預(yù)處理方案 高壓氧預(yù)處理組動(dòng)物置加壓艙，艙底置新鮮鈉石灰，純氧洗艙10min，使艙內(nèi) O2濃度 ＞98%，CO2濃度 ＜0.05%，以0.1 MPa/min的速度加至0.25 MPa(絕對(duì)壓)，高壓停留60min(期間以純氧通風(fēng)10min)，艙內(nèi)溫度維持在22～24℃。暴露結(jié)束后，勻速減壓15min至常壓，出艙。2次/d，進(jìn)艙時(shí)間分別為8:00和15:00，連續(xù)暴露2 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如有死亡，采用同標(biāo)準(zhǔn)的大鼠用同樣的辦法補(bǔ)充。

1.2.3 腸缺血再灌注模型建立 大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。備皮后常規(guī)麻醉、消毒、鋪巾，上腹部沿正中線切口，暴露并在根部游離腸系膜上動(dòng)脈，用小動(dòng)脈夾夾閉，腸管還納腹腔，腹部切口閉合，缺血45min后，從原切口再次入腹，松開(kāi)腸系膜前動(dòng)脈夾再灌注1 h。

1.2.4 腸道動(dòng)力測(cè)量 缺血再灌注后，在距離大鼠的屈式韌帶1cm處空腸內(nèi)注入葡聚糖藍(lán)-2000 0.4 mL，30min后大鼠頸椎脫臼處死，取出全部空腸測(cè)量空腸中葡聚糖藍(lán)-2000推進(jìn)距離及空腸全長(zhǎng)，計(jì)算空腸推進(jìn)率(葡聚糖藍(lán)-2000推進(jìn)距離/空腸全長(zhǎng)×100%)。

1.2.5 TNF-α測(cè)定 用無(wú)熱源注射器抽取大鼠肝門(mén)靜脈血適量，取掉針頭貼壁注入無(wú)熱源管中;靜置30min，離心 5min(3 500 r/min)，取得血清，使用TNF-α ELISA試劑盒，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)得492 nm處OD值，根據(jù)樣品OD值，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算出相應(yīng)樣品中TNF-α含量。

1.2.6 腸組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性測(cè)定 在距離回盲部1cm處取1cm長(zhǎng)小腸，用冷生理鹽水沖洗，清除黏液、污物等腸腔內(nèi)容物后進(jìn)行勻漿。使用髓過(guò)氧化物酶活力檢測(cè)試劑盒，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)得412 nm處OD值;根據(jù)樣品OD值使用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算出相應(yīng)樣品中MPO含量。

1.2.7 光鏡及透射電鏡觀察 在距離回盲部2cm處取1cm長(zhǎng)小腸，用4%甲醛液固定，經(jīng)梯度乙醇系列脫水，二甲苯透明后，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察記錄。在距離回盲部3cm處取面積為1 mm×1 mm的小腸組織，放入4%戊二醛固定，PBS漂洗，1%鋨酸固定2 h，丙酮梯度脫水，樹(shù)脂包埋，半薄切片定位，超薄切片，鈾染，鉛染，透射電鏡觀察。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，三組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組空腸動(dòng)力比較 與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和高壓氧預(yù)處理組的空腸推進(jìn)長(zhǎng)度和空腸推進(jìn)率明顯降低(P均＜0.01)。與缺血再灌注組相比，高壓氧預(yù)處理組的空腸推進(jìn)長(zhǎng)度和空腸推進(jìn)率明顯改善(P均＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組空腸動(dòng)力比較(n=10，±s)

表1 各組空腸動(dòng)力比較(n=10，±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01，與缺血再灌注組比較，#P＜0.01。

組別 空腸長(zhǎng)度(cm)空腸推進(jìn)長(zhǎng)度(cm)空腸推進(jìn)率(%)假手術(shù)組8.51±0.356 6.96±0.461 80.60±2.62缺血再灌注組 8.76±0.347 3.16±0.287* 37.90±3.49*高壓氧預(yù)處理組 8.58±0.316 5.04±0.384*#59.50±2.50*##

2.2 光鏡及電鏡觀察結(jié)果 光鏡下，假手術(shù)組小腸黏膜保持完整，腸絨毛形態(tài)正常;缺血再灌注組黏膜下水腫、淤血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸絨毛破壞，上皮細(xì)胞壞死，大量滲出，腸絨毛高度下降，數(shù)量減少;高壓氧預(yù)處理組黏膜下血管輕微充血，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。電鏡下，假手術(shù)組可見(jiàn)兩個(gè)吸收細(xì)胞之間正常的緊密連接、中間連接和橋粒，小腸微絨毛排列整齊;缺血再灌注組微絨毛減少，緊密連接、中間連接部分融合、模糊不清或消失;高壓氧預(yù)處理組微絨毛基本正常，細(xì)密，排列整齊，可見(jiàn)清晰的緊密連接、中間連接和橋粒。

2.3 各組MPO活性與血清TNF-α水平比較 與假手術(shù)組對(duì)比，缺血再灌注組和高壓氧預(yù)處理組MPO活性、血清 TNF-α水平顯著增高 (P均 ＜0.01);與缺血再灌注組相比，高壓氧預(yù)處理組腸組織MPO活性、血清TNF-α水平降低(P均＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組腸組織MPO活性和血清TNF-α水平測(cè)定(n=10，±s)

表2 各組腸組織MPO活性和血清TNF-α水平測(cè)定(n=10，±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01;與缺血再灌注組比較，#P＜0.01。

組別 MPO(U/g) TNF-α(pg/mL)假手術(shù)組0.05±0.006 29±5.461缺血再灌注組 0.18±0.025* 101±18.287*高壓氧預(yù)處理組 0.11±0.024*# 55±12.384*#

3 討論

完整的腸道功能包括機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障，其中以機(jī)械屏障最為重要［3］。機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為黏液層、完整的腸黏膜上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞間的緊密連接［4～7］。當(dāng)機(jī)體遭受?chē)?yán)重創(chuàng)傷、免疫力下降、便秘、嚴(yán)重感染、休克等情況時(shí)，可直接或間斷破壞腸道機(jī)械屏障。

缺血再灌注損傷是組織器官在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，其自身?yè)p傷反而加重的現(xiàn)象。缺血再灌注損傷是創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染及休克等疾病共同存在的病理生理過(guò)程，可導(dǎo)致許多嚴(yán)重并發(fā)癥，是外科常見(jiàn)的組織器官損傷之一［8］。小腸是對(duì)缺血再灌注損傷最敏感的器官之一，在腹部外傷、失血性休克、腸絞窄、小腸移植和腸系膜血管缺血性疾病等情況下，均會(huì)造成小腸的缺血性損傷，在組織恢復(fù)血供時(shí)，再灌注損傷進(jìn)一步加重對(duì)小腸的損傷，引起腸黏膜機(jī)械屏障損害，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致 SIRS、MODS［9］。本實(shí)驗(yàn)中缺血再灌注組小腸上皮細(xì)胞壞死，大量炎性細(xì)胞滲出，緊密連接部分融合、模糊不清或消失。表明缺血再灌注損傷能夠破壞大鼠腸道的機(jī)械屏障。

高壓氧作為一種輔助治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種缺血再灌注損傷模型，如心肌、骨骼肌、腦、肝臟、腎臟等，并取得滿意結(jié)果。Daniel等發(fā)現(xiàn)高壓氧治療能明顯降低腸缺血再灌注后大鼠腸黏膜的凋亡指數(shù)。Chen等［10］證實(shí)，高壓氧預(yù)處理能減少大腦炎性細(xì)胞的滲出，減少M(fèi)DA的生成，增加ATP的產(chǎn)量，明顯減輕大腦的再灌注損傷。Wada等［11］發(fā)現(xiàn)，高壓氧預(yù)處理能提高熱休克蛋白的表達(dá)，從而也揭示了高壓氧預(yù)處理能使腦組織對(duì)缺氧缺血產(chǎn)生耐受的機(jī)制之一。有研究表明，高壓氧預(yù)處理可模擬缺血預(yù)處理，誘導(dǎo)脊髓缺血耐受，而且高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)的脊髓缺血耐受效應(yīng)可以被氧自由基清除劑二甲基硫脈消除，證實(shí)氧自由基在高壓氧預(yù)處理機(jī)制中具有重要意義。由于自由基與抗氧化酶之間存在著密切關(guān)系，高壓氧預(yù)處理作為一個(gè)預(yù)刺激，在其處理期間，可能通過(guò)自由基的增多上調(diào)神經(jīng)元抗氧化酶水平，提高神經(jīng)元的抗氧化能力，從而增加了對(duì)隨后氧化損傷的耐受性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高壓氧預(yù)處理組小腸黏膜血管輕微充血，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，微絨毛基本正常，細(xì)密，排列整齊，可見(jiàn)清晰的緊密連接、中間連接和橋粒。證實(shí)高壓氧能夠減輕大鼠腸機(jī)械屏障的缺血再灌注損傷。

MPO是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒產(chǎn)生的一種重要的過(guò)氧化物酶，主要存在于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中，MPO也是一種血紅素蛋白，可作為中性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，反映炎癥損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腸組織MPO活性較低，缺血再灌注組和高壓氧預(yù)處理組顯著增高，表明經(jīng)受腸缺血再灌注后，大鼠腸組織出現(xiàn)明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)積聚，導(dǎo)致組織髓過(guò)氧化物酶水平顯著升高。與缺血再灌注組相比，高壓氧預(yù)處理組腸組織MPO活性較低，表明高壓氧預(yù)處理能夠顯著改善中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，減低MPO活性。活化的中性粒細(xì)胞除自身釋放各種炎癥介質(zhì)外，還可刺激單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如 TNF-α、lL-6、IL-1、lL-2、IL-8、PAF 和白細(xì)胞三烯等。Zhang等［12］研究顯示，大鼠發(fā)生腸缺血再灌注損傷時(shí)，門(mén)靜脈和外周血清TNF-α水平顯著升高，所以，TNF-α可能是腸缺血再灌注損傷時(shí)的關(guān)鍵性炎癥介質(zhì)之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組對(duì)比，缺血再灌注組和高壓氧預(yù)處理組TNF-α水平顯著增高，表明經(jīng)受腸缺血再灌注后，血清中炎性細(xì)胞因子大量釋放。與缺血再灌注組相比，高壓氧預(yù)處理組血清TNF-α活性較低，提示高壓氧預(yù)處理能抑制血清中炎性細(xì)胞因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)損傷［13］。

總之，高壓氧預(yù)處理能減輕大鼠腸缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及中性粒細(xì)胞積聚，減輕大鼠腸機(jī)械屏障的缺血再灌注損傷。高壓氧預(yù)處理作為一種干預(yù)因素，能激發(fā)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，從而減輕其后所受到的組織缺血、創(chuàng)傷等因素引起的組織損傷，有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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