款冬花藥典質(zhì)量標準探究

祿曉艷，曹 炯△

1甘南藏族自治州食品藥品檢驗檢測所，甘肅甘南747000；2甘肅省藏藥檢驗中心

款冬花藥典質(zhì)量標準探究

祿曉艷1，2，曹 炯1，2△

1甘南藏族自治州食品藥品檢驗檢測所，甘肅甘南747000；2甘肅省藏藥檢驗中心

目的：對《中國藥典》2010年版中款冬花藥材的薄層色譜檢測方法及款冬酮含量測定檢測方法同時進行改進。方法：使用正相硅膠薄層板，通過嘗試不同展開系統(tǒng)和檢測方法，并與藥典方法相對照；采用高效液相色譜法(HPLC)法測定款冬花中款冬酮的含量。色譜柱：Iner tsi l ODS-SPC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-水(77∶23)；流速：1.0mL/min；檢測波長：219 nm。結(jié)果：在新薄層色譜條件下，對照品斑點具有更好的分離度，無干擾，易于檢測；款冬酮在0.524～1.572μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 9，n=5)；平均回收率：98.70%，RSD=0.80%（n=9）。結(jié)論：新方法優(yōu)于藥典方法，可用于款冬花藥材中款冬酮的定性、定量測定。

款冬花；薄層色譜；款冬酮；高效液相色譜法；含量測定

中藥材款冬花是菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，又稱冬花、艾冬花、九九花、虎須等,具有潤肺下氣、止咳化痰之功效，用于新久咳嗽、喘咳痰多、癆嗽咳血等［1］。對于藥材的質(zhì)量控制［2］，2010版藥典一部款冬花項下，選用款冬花對照藥材及其指標成分款冬酮(tussi lagone)化學對照品，對該藥材進行薄層色譜鑒別和高效液相含量測定。實際檢測中，當應(yīng)用藥典薄層色譜條件進行藥材鑒別時，需要進行同向二次展開，但是往往由于藥材中存在相似極性物質(zhì)的影響，在與款冬酮相似比移值的附近存在其他斑點，于藥典方法規(guī)定濃度下，款冬酮斑點顯色深度一般較干擾斑點淺，干擾了樣品中款冬酮的識別，容易造成藥材鑒別結(jié)果的誤判。我們通過對比研究，確定了新的展開系統(tǒng)，在此條件下，款冬酮可以被有效分離且斑點清晰易辨，為款冬花藥材的鑒別提供了另一個可供選擇的方法。同時，用高效液相色譜法(HPLC)法測定其款冬酮含量(以下簡稱藥典方法)，在藥典方法執(zhí)行過程中發(fā)現(xiàn)，其色譜行為不佳(款冬酮峰與鄰近雜質(zhì)峰分離不完全、色譜柱在多批進樣時不耐用、柱效完全達不到藥典方法規(guī)定等)。筆者優(yōu)化色譜條件及供試品溶液的制備方法，提高了款冬酮含量測定方法的有效性、重復性、耐用性。并經(jīng)方法學驗證，結(jié)果表明該方法準確、分離效果好、專屬性強，可作為款冬花含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津SPD-20A高效液相色譜儀(日本島津提供)及其配套工作站包括：紫外檢測器：SPD-20A；LC-20A泵(四元梯度單元)、SIL-20A自動進樣器、CTO-10AS柱溫箱、CBM-20A控制器、SUS20A混合器；EL204-IC電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司提供)；WFH-201BJ薄層呈像系統(tǒng)；LINOMAT5半自動點樣機；U-3900H紫外可見分光光度計(通微上海分析技術(shù)有限公司提供)；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供)。

1.2 試藥 款冬花對照藥材(薄層色譜用，中國藥品生物制品檢定所，批號：121449-201002)；款冬酮對照品(含量測定用，中國藥品生物制品檢定所提供，批號：111884-201102)；款冬花樣品(亳州豪門中藥飲片有限公司提供，批號：121201；山東嘉泰中藥飲片有限公司提供，批號：120212；張掖市恒利中藥飲片加工有限公司提供，批號：120101)；硅膠GF254薄層板(青島海洋化工廠提供)；甲醇為色譜純；水為超純水；中性氧化鋁(100～200目)；其他試劑均為分析純。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品及對照藥材溶液的制備 取款冬花粉末1 g(過四號篩)，加乙醇20mL，超聲處理1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加1mL乙酸乙酯使溶解，作為供試品溶液。同法制備對照藥材溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取款冬酮5mg，加5mL乙酸乙酯使溶解定容，制成1mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 展開系統(tǒng) 方法比較了數(shù)個展開系統(tǒng)，最終選擇石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(4∶1，v/v)為新的展開體系；并與藥典提供的石油醚-丙酮(6∶1，v/v)展開體系進行了比較，其中前者為單次展開，后者為同向二次展開。

2.1.4 檢視 置紫外燈254 nm下檢視。

2.1.5 結(jié)果 參見圖1—2。

圖1 改進方法薄層色譜(石油醚60～90℃-乙酸乙酯，4∶1，一次展開)

圖2 藥典方法薄層色譜(石油醚60～90℃-丙酮，6∶1，兩次展開)

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱：Iner tsi l ODS-SP C18柱加C18保護柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相:甲醇-水(77∶23)，流速：1.0mL/min，柱溫:30℃，檢測波長：219 nm，進樣量：20μL。理論板數(shù)按款冬酮峰計算應(yīng)不低于5 000。款冬酮峰與其他雜質(zhì)峰分離度應(yīng)大于1.5［3］。

2.2.2 供試品溶液的制備 取款冬花藥材粉末1 g(過四號篩)，精密稱定，加乙醇20mL，超聲提取60分鐘，濾過，精密量取續(xù)濾液10mL，通過中性氧化鋁柱(100～200目，內(nèi)徑1.5 cm，2 g)，用乙醇20mL洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取款冬酮對照品13.10mg，置25mL量瓶中，加流動相使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置10mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.3”項下的對照品溶液，分別精密量取10、15、20、25、30 mL，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，以進樣量為橫坐標、峰面積積分值為縱坐標，求得回歸方程：

Y=1.1946×105+0.5411×105，r=0.999 9結(jié)果表明，款冬酮在0.524～1.572μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.3”項下的對照品溶液20μL，分別重復進樣5次，測得款冬酮峰面積的平均值為2 374 326，RSD=0.09%(n=5)。

2.2.6 重復性試驗 取同一批號(批號：121201)的樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，計算款冬酮平均含量為0.074%，RSD=0.95%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批號的供試品溶液(批號：120101)20μL，分別于配置后0、2、4、8、12、16小時，進樣測定，測得款冬酮峰面積平均值為3 740 019.75，RSD=0.42%。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量同一批號的樣品(批號：120101款冬酮含量0.75mg/g) 0.4、0.5、0.6 g各3份，分別精密加入款冬酮對照品溶液(0.050 24mg/mL)6、7.5、9mL各3份。按“2.2.2”項下方法制成所需溶液，并按上述色譜條件測定款冬酮含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果(n=9)

2.2.9 樣品測定結(jié)果 取3個批號的樣品，按“2.2.2”項下方法及標準方法制備供試品溶液。精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀。按本法及標準方法中的色譜條件測定，記錄色譜圖(圖3—4)。以外標法計算樣品中款冬酮含量。結(jié)果見表2。

圖3 改進方法圖譜

圖4 藥典方法圖譜

表2 兩種測定方法結(jié)果比較(n=4)

3 討論

款冬花藥材，在用藥典方法操作時，由于藥材樣品中存在和款冬酮極性相似的物質(zhì)，在款冬酮對應(yīng)斑點上方相似比移值下，通常會存在較大且顏色深于款冬酮的斑點，在該定性條件下，嚴重干擾了藥材的識別，因此有必要對展開系統(tǒng)進行調(diào)整，以提高分離度，加強結(jié)果辨識的準確性。在利用藥典提供的展開系統(tǒng)，進行了一次及二次展開后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾斑點與款冬酮斑點比移值相似，即使在展距延長的狀態(tài)下，也不能得到有效分離，經(jīng)試驗換用多種展開系統(tǒng)后，最終確定，石油醚60～90℃-乙酸乙酯(4∶1)及正已烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開系統(tǒng)時，均可得到不錯的分離效果，兩者皆可用于款冬花的鑒別。并用此方法對72批款冬花進行了薄層鑒別,通過方法驗證［3］，此法檢測靈敏度、分離度和重復性要求均達到藥典規(guī)定，獲得滿意的分離和鑒別結(jié)果。

測定款冬酮含量［4-9］時發(fā)現(xiàn)，藥典方法提取物，洗脫時雜質(zhì)峰及相似峰對于主成分峰的影響比較大，理論板數(shù)很難達到藥典標準的規(guī)定，尤其是在大批量的檢驗中，弊端顯得極為明顯；經(jīng)過中性氧化鋁過柱處理后，情況得到有效改善。流動相的選擇上，將甲醇∶水的比例稍作調(diào)整后，主峰理論板數(shù)能有效提高近一倍之多，且大批量檢驗時無明顯柱效下降現(xiàn)象，易洗脫，不易損害柱子，使柱子的耐用性得到很大的提高，這點在我們基層所顯的尤為重要。在檢測波長的選擇上，我先將對照品溶液在紫外分光光度儀下進行最大吸收掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在219 nm波長處，對照品溶液有最大吸收，因此選擇219 nm作為檢測波長。

按藥典方法測定樣品含量，均比本法含量略低。由于藥典方法中款冬酮與鄰近峰未完全分開或影響主峰的出峰，致使主峰理論板數(shù)大大降低，從而引起峰面積積分結(jié)果降低，導致款冬酮含量重現(xiàn)性極差。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：312.

［2］ 姜瀟，黃湘鷺，曹進，等.款冬花薄層色譜藥典方法改進及對藥典中薄層方法應(yīng)用的思考［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2012，10(17)：156-158.

［3］ 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：224-227.

［4］ 石巍，高建軍，韓桂秋，等.款冬花的化學成分研究［J］.北京醫(yī)科大學報，1996，28(4)：308-309.

［5］ 王長岱，米采風，喬博靈，等.款冬花的化學成分研究［J］.藥學學報，1989，24(12)：913-916.

［6］李瑋，楊秀偉.HPLC法同時測定款冬花中9個主要成分的含量［J］.藥物分析雜志，2012，32(9)：1517-1524.

［7］ 張志偉，馬致潔，董紅紅，等.不同產(chǎn)地款冬花中款冬酮的測定［J］.中草藥，2009，40(7)：284-286.

［8］肖培根.新編中藥志［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2000：173-174.

［9］ 劉世端，陳剛.關(guān)于藥物定量分析中回收率計算的淺見［J］.華西藥學雜志，1993，8(3)：177-178.

Studieson theQuality Standardsof KuanDongHua in Pharm acopoeia

LU Xiaoyan1,2,CAO Jiong1，2△
1 Gannan Tibetan Autonomous Prefecture Institute for Drug Control,Gannan 747000,China; 2 Tibetan Medicine Inspection Center of Gansu Province

Objective:To simultaneously improve the thin layer chromatography(TLC)method for Kuan－DongHua(flos farfarae)appeared in Chinese Pharmacopoeia and the determ inationmethod for tussilagone contents. Methods:The normal-phase thin-layer silica gel plate was used to detect KuanDongHua by trying different systems and determ iningmethods,compared to themethod used by Pharmacopoeia;the HPLCmethod was applied to test the tussilagone content.The chromatographic column:InertsilODS-SPC18column(250mm×4.6mm,5μm);mobile phase:methanol-water=77/23;flow rate:1.0m L/min;detectionwavelength:219 nm.Results:Under the condition of new thin layer chromatography,the spotsof the standard substancewerew ith better separation degree and no interferencewere easy to detect;the contents of the tussilagonew ithin 0.524～1.572μg had a good linear relationship(r=0.999 9,n=5);the average recoverywas98.70%,RSD=0.80%(n=9).Conclusion:Thenew method is superior to themethod used in Pharmacopoeiaand can be used for the qualitative and quantitative determ ination of tussilagone contents.

KuanDongHua;TLC;tussilagone;HPLC;contentdeterm ination

R259

A

1004-6852(2015)02-0030-04

2014-07-23

祿曉艷(1981—)，女，主管中藥師。研究方向：藥品檢驗和質(zhì)量標準研究。

△通訊作者：曹炯(1965—)，男，副主任中藥師。研究方向：藥品檢驗和質(zhì)量標準研究。