星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)選白芷中歐前胡素和異歐前胡素的醇提工藝

李 靖，路莎莎

張掖市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅張掖734000

星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)選白芷中歐前胡素和異歐前胡素的醇提工藝

李 靖，路莎莎

張掖市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅張掖734000

目的：利用效應(yīng)面法優(yōu)選白芷的醇提取工藝參數(shù)。方法：采用HPLC方法，Waters公司的Sunf ire C18色譜柱（150 mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇-水（70∶30），等度洗脫；流速0.9mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30℃；分析時(shí)間為20分鐘；進(jìn)樣量10μL。結(jié)果：白芷中歐前胡素的最佳提取工藝為甲醇濃度83.17%，提取時(shí)間9.15小時(shí)，甲醇用量為147.32mL；異歐前胡素的最佳提取工藝為甲醇濃度91.83%，提取時(shí)間9.15小時(shí)，甲醇用量為112.68mL。結(jié)論：采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)與效應(yīng)面法相結(jié)合的方法對實(shí)驗(yàn)工藝優(yōu)化更方便、更準(zhǔn)確。

白芷；歐前胡素；異歐前胡素；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；效應(yīng)面法

白芷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hof fm.)Benth.et Hook.f或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hof fm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan的干燥根，因初生根桿為芷，色白，故名白芷，其性溫，氣芳香，味辛，微苦，具有散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿的作用，臨床廣泛應(yīng)用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶、瘡瘍腫痛等病癥，并有較好的療效［1-2］。白芷全株含揮發(fā)油，由根揮發(fā)油中檢出29種化合物，其質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分為歐前胡素和異歐前胡素［3］。星點(diǎn)設(shè)計(jì)是在二水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加上星點(diǎn)(star point)及中心點(diǎn)(cent ral point)而成的實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，適宜進(jìn)行非線性擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，具有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單，試驗(yàn)次數(shù)少，精密度高的特點(diǎn)［4-6］，筆者使用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法三維效應(yīng)面法對白芷中歐前胡素和異歐前胡素的提取工藝進(jìn)行篩選，優(yōu)選出最佳的方法，為白芷中有效成分提取分離工藝研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 藥材與試劑、儀器

1.1 藥材 經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院楊福德教授鑒定為杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hof fm.) Benth.et Hook.f.var.form osana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，均為正品藥材。

1.2 試劑 歐前胡素(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司提供，純度大于99.9%，批號：DQ201010)，異歐前胡素(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司提供，純度大于99.9%，批號：YD201012)，甲醇(天津市紅巖化學(xué)試劑廠提供)，乙腈色譜純(成都金山化學(xué)試劑有限公司提供)，哇哈哈純凈水等。

1.3 儀器 高效液相色譜儀(Waters600、四元泵、在線脫氣系統(tǒng)、手動進(jìn)樣系統(tǒng)、Waters2487型紫外-可見檢測器、Empower色譜工作站)；超聲波清洗器(KQ2200DB，40 kHz，80W，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司提供)；BS201型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司提供)；回流裝置。

1.4 色譜條件色譜柱：Waters公司的Sunf ire C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動相為甲醇-水(70∶30)，等度洗脫；流速0.9mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30℃；分析時(shí)間為20分鐘；進(jìn)樣量10μL；歐前胡素的保留時(shí)間為(9.489±0.007)分鐘；異歐前胡素的保留時(shí)間(14.767±0.012)分鐘；各樣品色譜圖中，分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)大于3 000；拖尾因子在0.95～1.05之間。

1.5 溶液制備

1.5.1 對照品溶液 精密稱取異歐前胡素對照品1.80mg，加甲醇50mL制成濃度為0.036mg/mL的對照品溶液；精密稱取歐前胡素對照品1.75mg，加甲醇50mL制成濃度為0.035mg/mL的對照品溶液。

1.5.2 供試品溶液 參照《中國藥典》白芷含量測定項(xiàng)下供試品溶液的制備方法［7］。稱取5 g份的白芷樣品20份按照據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)方案，甲醇濃度、提取時(shí)間、加入甲醇量3個(gè)自變量的水平極值分別為：X1(甲醇濃度)：80%～95%；X2(提取時(shí)間)6～10小時(shí)；X3(甲醇用量)100～160mL配制待用。

2 方法學(xué)考察

2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品異歐前胡素溶液0.5、1.0、2.5、3.0、4.0、5.0mL置于10mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20μL，以對照品濃度對峰面積積分分值線性回歸得異歐前胡素的回歸方程為：Y=6.6×107X-1.761 9×104，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2。精密吸取對照品歐前胡素溶液0.4、0.6、2.0、3.0、5.0mL置于5mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20μL，以對照品濃度對峰面積積分分值線性回歸得歐前胡素的回歸方程為：Y=6.2×107X-1.07×104相關(guān)系數(shù)r=0. 999 1。結(jié)果表明異歐前胡素和歐前胡素的含量分別在0.001 8～0.018 mg/mL和0.002 8～0.035mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一濃度的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，得到異歐前胡素和歐前胡素峰面積，計(jì)算異歐前胡素峰面積的RSD為0.37% (n=5)，歐前胡素的峰面積的RSD為0.30%(n=5)，表明本方法精密度良好。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取白芷，按供試品制備方法制備5份樣品溶液，得到異歐前胡素和歐前胡素峰面積，計(jì)算歐前胡素峰面積的RSD為1.46% (n=5)，異歐前胡素峰面積RSD為1.51%(n=5)。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取白芷的供試品溶液，分別在0、2、6、8、12小時(shí)進(jìn)樣測定，計(jì)算歐前胡素峰面積的RSD為0.99%(n=5)，異歐前胡素的峰面積的RSD為2.39%(n=5)，結(jié)果表明樣品在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一已知含量的樣品6份，分別精密加入一定量的對照品，制得樣品溶液后，依法進(jìn)樣測定，結(jié)果歐前胡素的回收率為97.6%，RSD為1.7%，異歐前胡素的回收率為98.8%，RSD為1.5%。

3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)選白芷提取工藝

3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇對甲醇提工藝影響較大的因素，即醇提濃度、提取時(shí)間、甲醇用量3個(gè)主要因素。水平安排遵循任意兩個(gè)物理量之間的差值與對應(yīng)代碼之間差值成等比的原則。采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，用效應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，并進(jìn)行預(yù)測分析。如以X2為例，代碼1所對應(yīng)的物理量N的求算：(N-6)/ (10-6)=[1-(-1.732)]/[1.732-(-1.732)]，N=[1-(-1.732)]/[1.732-(-1.732)]×(24-6)+6=9.2。3個(gè)因素的取值見下表，以歐前胡素和異歐前胡素提取率、相對總峰面積做為評價(jià)指標(biāo)來優(yōu)選醇提工藝，因素水平見表1。

表1 甲醇提工藝3個(gè)考察因素的代碼水平及對應(yīng)物理量

3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 取白芷藥材50 g，按照表1中實(shí)驗(yàn)安排進(jìn)行提取，HPLC測定溶液中歐前胡素和異歐前胡素含量，并計(jì)算其提取率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及供試品重疊色譜圖見圖1、表2。

圖1 重疊色譜圖

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

4 數(shù)據(jù)處理

4.1 模型擬合 以樣品白芷中歐前胡素和異歐前胡素提取率為因變量，對各因素進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式擬合。多元線性回歸擬合模型為：Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3。

實(shí)際方程為：Y1=+0.143 65+1.173 87E-003X1+0.033 053 X2-1.11301E-003X3(相關(guān)系數(shù)R=0.089，F(xiàn)=4.00，Df=16，P=0.066 8，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=0.080)。由模型方程參數(shù)F=4.00，Df= (5，11)，P值=0.066 8＞0.05，可以看出，方程的擬合度不佳，預(yù)測性較差。

Y2=0.059 096+7.664 54E-004X1+ 2.09016E-003X2-6.46398E-004X3(相關(guān)系數(shù)R=3.638E-003，F(xiàn)=0.53，Df= (11，16)，P=0.8249，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=1.954E-003)。由模型方程參數(shù)F=4.00，Df=16，P=0.8249＞0.05，可以看出，方程的擬合度不佳，預(yù)測性較差。

二次多項(xiàng)式回歸擬合模型為：Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X12+b5X22+b6X32+b7X1X2+b8X2X3+b9X1X3

實(shí)際方程為：Y1=0.58411-0.053396X1+0.26635X2+0.014 489X3-3.17345E-003X1X2-37583E-004X1X3+ 1.52336E-003X2X3+6.92817E-004X12-9.60387E-003X22(相關(guān)系數(shù)R=0.96，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)Ra=0.98，F(xiàn)=5.54，Df=(6，11)，P=0.0114)二次多項(xiàng)式相關(guān)系數(shù)R=0.96，P=0.0114＜0.05，與線性擬合相比有較大提高，說明該方程有較高的可信度。

Y2=-3.62350E-003X1-0.019468X2-4.67639E-003X3+7.21110E-004X1X2-4.02828E-005X1X3+1.71972E-004X2X3+ 2.17933E-005X12-3.99679E-003X22-1.22226E-005X32(相關(guān)系數(shù)R=0.94，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)Ra=0.95，F(xiàn)=14.38，Df=(6，11)，P=0.0051)二次多項(xiàng)式復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.94，P=0.0051＜0.05，與線性擬合相比有較大提高，說明該方程有較高的可信度。

4.2 工藝優(yōu)化 根據(jù)二次多項(xiàng)式方程，繪制各考察指標(biāo)與另外兩個(gè)試驗(yàn)因素的三維反應(yīng)曲面關(guān)系圖，以歐前胡素為例，結(jié)果見圖2—4。

圖2 歐前胡素(Y1)提取率對甲醇濃度和提取時(shí)間的三維效應(yīng)面圖

圖3 歐前胡素(Y1)提取率對甲醇濃度和甲醇用量的三維效應(yīng)面圖

圖4 歐前胡素(Y1)提取率對提取時(shí)間 和甲醇用量的三維效應(yīng)面圖

4.3 工藝驗(yàn)證 為驗(yàn)證所建立的數(shù)學(xué)模型，分別針對歐前胡素和異歐前胡素各選擇3組不同條件的平行試驗(yàn)，得到的實(shí)測值與數(shù)學(xué)模型得到的預(yù)測值進(jìn)行比較，驗(yàn)證預(yù)測值與實(shí)際值偏差較小顯示方程預(yù)測性很好，結(jié)果見表3。

表3 工藝驗(yàn)證

5 結(jié)果與討論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是二元多因素五水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［8-12］。常常被用來對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。它是目前國外使用較廣泛的一種優(yōu)化設(shè)計(jì)方法，該實(shí)驗(yàn)是由2次的因子實(shí)驗(yàn)、2次的軸實(shí)驗(yàn)和計(jì)算出的中點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組成［13-16］。根據(jù)實(shí)際情況，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖直接選取最大提取率各因素最佳取值：歐前胡素的最佳提取工藝為甲醇濃度83.17%，提取時(shí)間為9.15小時(shí)，甲醇用量為147.32mL；異歐前胡素的最佳提取工藝為甲醇濃度91.83%，提取時(shí)間為9.15小時(shí)，甲醇用量為112.68mL。

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AlcoholExtraction of Im peratorin and Isoim peratorin from Selected Baizhiby CCD and RSM

LIJing,LU Shasha
Zhangye Hospital of Chinese Medicine,Zhangye 734000,China

Objective:To collect the extracting parameters of the alcohol from Baizhi(angelica dahurica)by central composite design(CCD)and response surfacemethod(RSM).Methods:The HPLCmethod was performed and the detected conditionswere defined,chromatography column:Waters'Sunfire C18(150mm×4.6mm,5μm); mobile phase:CHOH/H2O=70/30,isocratic elution;flow rate:0.9m L/m in;detection wavelength:254 nm;column temperature:30℃;analyzing time:20min;injection volume:10μL.Results:The bestconcentration ofmethanol for extracting the imperatorin from Baizhi was83.17%,the extracting timewas9.15 hoursand themethanoldosagewas 147.32m L，while forextracting the isoimperatorin the bestconcentration ofmethanolwas91.83%w ith 9.15 extracting hours and 112.68 m Lmethanol dosages.Conclusion:Themethod of combining CCD and RSM is easier and more accurate foroptim izing the extracting process.

Baizhi;imperatorin;isoimperatorin;CCD;RSM

R259

A

1004-6852(2015)02-0023-04

2014-07-10

李靖(1979—)，男，主管藥師。研究方向：中藥提取。