參橘止咳滴丸微生物限度檢查法的建立和最大耐受量實驗*

李 娟，封士蘭，郭朝暉

1甘肅省人民醫(yī)院，甘肅蘭州730000；2蘭州大學藥學院；3甘肅省食品藥品檢驗所

參橘止咳滴丸微生物限度檢查法的建立和最大耐受量實驗*

李 娟1，封士蘭2，郭朝暉3

1甘肅省人民醫(yī)院，甘肅蘭州730000；2蘭州大學藥學院；3甘肅省食品藥品檢驗所

目的：建立參橘止咳滴丸微生物限度檢查方法，并測定其最大耐受量。方法：測定參橘止咳滴丸對5種驗證菌株的回收率，并對控制菌的檢查法進行驗證；同時，小鼠灌胃給予參橘止咳滴丸120 g/（kg·d）(相當于人臨床用量的2 290.08倍)，觀察14天，記錄有無死亡發(fā)生，確定小鼠對參橘止咳滴丸的最大耐受量。結果：回收率試驗結果表明，參橘止咳滴丸供試品試驗菌的回收率試驗均高于70%，證明無抑菌現(xiàn)象；一次性給予高劑量參橘止咳滴丸，經(jīng)過14天的連續(xù)觀察，小鼠無死亡且一般狀態(tài)良好。結論：參橘止咳滴丸可按常規(guī)方法進行微生物限度檢查，且具有較高的安全性。

參橘止咳滴丸；微生物限度；最大耐受量

參橘止咳滴丸是以甘肅省名中醫(yī)徐鴻達主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗方為依據(jù)，采用現(xiàn)代制劑技術研制的滴丸劑，其處方主要由玄參、陳皮等中藥組成，具有清熱抗炎，止咳利咽的功效，對外感咳嗽和慢性氣管炎急性發(fā)作引起的咳嗽療效確切［1］。本實驗根據(jù)2010版《中國藥典》微生物限度檢查法的相關規(guī)定，建立參橘止咳滴丸的微生物限度檢查方法，進行方法驗證，并通過最大耐受量試驗來評價其安全性，以期為參橘止咳滴丸開發(fā)使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 參橘止咳滴丸(甘肅隴神戎發(fā)制藥有限公司提供，批號：20061009、20061209、20070214)。

1.2 實驗材料 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基；大腸埃希菌［CMCC (B)44 102］，金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］，枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63 501］，白色念珠菌［CMCC(F)98 001］，黑曲霉［CMCC(F)98 003］，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 實驗動物 昆明種小白鼠40只，體質量18～22 g，由蘭州大學實驗動物中心提供［動物實驗合格證號：SYXK(甘)2005-0007］。

1.4 實驗儀器 超凈臺 (蘇州凈化設備公司提供)；電熱鼓風干燥箱(天津市實驗儀器廠提供)；JT75-2型隔水式培養(yǎng)箱(余姚縣恒溫箱廠提供)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(南京實驗儀器廠提供)。

1.5 方法

1.5.1 最大耐受量實驗［2-5］取小鼠40只，雌雄各半，按體質量隨機分為給藥組和對照組。給藥組灌胃給予參橘止咳滴丸120 g/(kg·d)(相當于人臨床用量的2 290.08倍)，對照組灌胃給予同體積的生理鹽水。于末次給藥后觀察小鼠14天內體質量變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排便物、死亡情況及中毒反應。對瀕死及死亡動物及時進行解剖，其他動物于觀測結束后進行解剖，當發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質地等改變時則對改變的器官進行組織病理學檢查。

1.5.2 微生物限度檢查方法驗證實驗［6-9］

1.5.2.1 菌液制備 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24小時的枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的肉湯培養(yǎng)物1mL，取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48小時的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1mL，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級地稀釋至10-5～10-7，菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，做菌液組計數(shù)，備用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)7天的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取霉菌孢子液1mL加9mL0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級地稀釋為10-4，菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，備用。

1.5.2.2 供試液制備 稱取供試品10g，至pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，置45℃水浴中使溶解，搖勻，制成1∶10供試液。

1.5.2.3 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法驗證(回收率測定)實驗組：取1∶10的供試液各1mL分別注入2個平皿中，加入50～100 cfu實驗菌，立即傾注涼至45℃的熔化的相應的瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，搖勻，凝固后，將平皿倒置于規(guī)定的溫度培養(yǎng)至規(guī)定的時間，計數(shù)。菌液組：取實驗菌液各1mL，分別放入2個平皿中，立即傾注涼至45℃的熔化的相應的瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，搖勻，凝固后，將平皿倒置于規(guī)定的溫度培養(yǎng)至規(guī)定的時間，測定所加的驗證菌數(shù)。供試品對照組：取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

1.5.2.4 控制菌檢驗方法 取1∶10供試液各10mL，分別加入2瓶各含100mL的膽鹽乳糖增菌液中，其中1瓶加10～100 cfu大腸埃細菌，另1瓶加10～100 cfu金黃色葡萄球菌，置于規(guī)定溫度培養(yǎng)至18～24小時。

1.6 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 16.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，計量資料以(±s)表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 最大耐受量實驗 給小鼠單次灌胃給予參橘止咳滴丸120 g/(kg·d)后，小鼠的精神反應、體毛膚色、呼吸步態(tài)、攝食飲水、排泄物及其他情況均無異常，未見明顯毒性反應及死亡情況。見表1—2。2組相比較，小鼠的體質量都明顯增加，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3。14天后解剖小鼠，肉眼及顯微鏡檢查未見臟器有明顯病理改變。

表1 參橘止咳滴丸最大耐受量實驗小鼠死亡情況

表2 參橘止咳滴丸最大耐受量實驗小鼠反應情況

表3 參橘止咳滴丸最大耐受量實驗小鼠的體質量變化(±s)g

表3 參橘止咳滴丸最大耐受量實驗小鼠的體質量變化(±s)g

注：*表示與對照組比較，P＞0.05。

組別 只數(shù) 0天 7天 14天對照組20 19.76±1.29 26.12±1.99 29.95±3.10給藥組20 19.87±1.24*25.89±2.21*30.00±3.02*

2.2 微生物限度檢查方法驗證實驗 通過對參橘止咳滴丸進行3次獨立的平行實驗，發(fā)現(xiàn)實驗組的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率都遠高于70%，符合藥典規(guī)定，說明參橘止咳滴丸可以采用常規(guī)法進行菌數(shù)計數(shù)方法驗證。見表4。通過對參橘止咳滴丸控制菌檢查，陰性對照菌組均未檢出大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，說明可以采用常規(guī)法對參橘止咳滴丸進行控制菌檢驗。見表5。

表4 常規(guī)法測定各實驗菌株的回收率 %

表5 控制菌驗證結果

3 討論

3.1 最大耐受量實驗 參橘止咳滴丸處方中的玄參和陳皮均非毒性藥材，亦無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學處理(水、乙醇粗提除外)，由于預實驗無法測出該復方制劑的半數(shù)致死量(LD50)，提示該中藥復方制劑安全范圍很大，所以改做小鼠最大耐受量實驗［120 g/(kg·d)，相當于人臨床用量的2 290.08倍)。試驗發(fā)現(xiàn)：小鼠最大量灌胃給藥后14天內，其在攝食、飲水、糞便、尿液及精神、四肢活動和體質量方面，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明參橘止咳滴丸安全范圍較大，在正常劑量無毒副作用，服用安全。

3.2 微生物限度檢查方法驗證試驗 本實驗依照《中國藥典》2010年版建立參橘止咳滴丸的微生物限度檢查方法，并對控制菌的進行方法學驗證，其驗證菌株為5種，其中大腸埃希菌代表革蘭氏陰性桿菌、金黃色葡萄球菌代表革蘭氏陽性球菌、白色念珠菌代表酵母菌、黑曲菌代表霉菌和枯草芽孢桿菌是代表藥品中常見的污染菌-芽孢桿菌。通過實驗發(fā)現(xiàn)參橘止咳滴丸對實驗菌的回收率試驗均高70%，控制菌檢查具有較好的專屬性，因此，其微生物限度檢查可按常規(guī)法進行。

［1］ 徐靜汶，劉小花，趙良功，等.高效液相色譜法同時測定參橘止咳滴丸中肉桂酸、橙皮苷和哈巴俄苷含量［J］.浙江師范大學學報：自然科學版，2009，32(3)：313-314.

［2］ 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：886-887.

［3］ 陳奇.中藥藥理實驗方法學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：112-119.

［4］ 傅萍，鄧娟.血竭加味顆粒的急性毒性實驗最大給藥量(最大耐受量)的測定［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2008，32(5)：674-675.

［5］ 葉華，曾茂貴，羅戢彬凱，等.藍花參抗炎、止痛的藥效學與急性毒性試驗研究［J］.西部中醫(yī)藥，2012，25(5)：49-51.

［6］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅩⅢ.

［7］ 李曉東，李娟，郭朝暉，等.幾種醫(yī)院外用中藥制劑微生物限度檢查方法的建立［J］.西部中醫(yī)藥，2012，25(2)：25-27.

［8］ 章紅星，金建平.消炎利膽滴丸微生物限度檢查方法的建立［J］.北方藥學，2011，8(3)：9-10.

［9］ 代心平，諶樂剛.清開靈滴丸微生物限度檢查的方法學驗證［J］.海南醫(yī)學，2008，19(12)：87-88.

Study on the Establishm entofM icrobial Lim itand M TD Test for ShenJu ZhiKe D ripping Pills

LIJuan1,FENG Shilan2,GUO Zhaohui3
1 People′s Hospital of Gansu Province,Lanzhou 730000,China; 2 Pharmacy School of Lanzhou University; 3 Gansu Institute for Food and Drug Control

Objective:To establishmicrobial lim it testand measure themaximum-tolerated dose(MTD)of ShenJu ZhiKe dripping pills.Methods:The recovery ratesof5 verified strains treated by ShenJu ZhiKe dripping pills were detected by routinemethod,and them icrobial lim it testmethod for the controlbacteriawas validated;Meanwhile,ratswere observed continuously for14 daysafterbeing given ShenJu ZhiKe dripping pills120 g/(kg·d)by intragastric administration(equivalent to 2290.08 timesof the clinicaldosage),then the dead ratswere recorded and their MTD could be obtained.Results:The recovery rates of ShenJu ZheKe dripping pills for the verified strains were higher than 70%,which indicated no antim icrobialeffectof the pills;in the experimentofMTD,after rats being given ShenJu ZhiKe dripping pills of high dose one time,no rats died for 14-day observation and they were in perfectly good condition.Conclusion:M icrobial limit tests for ShenJu ZheKe dripping pills can be conducted w ith conventionalmethod and thehigher safety can beensured.

Shenju Zhike dripping pills；m icrobial limit test；MTD

R259

A

1004-6852(2015)02-0018-03

2014-08-27

蘭州市科技計劃項目(編號05-1-48)。

李娟(1981—)，女，主治醫(yī)師。研究方向：慢性病的康復治療。